QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen
Abstract
Wissenschaftliches Wissen ist mit den verfügbaren Technologien und Methoden verbunden. In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die die Identifizierung und Verifizierung eines Arzneimittelresistenzgens im Apikomplexan-Parasiten Toxoplasma gondii , der Methode der quantitativen Trait Locus (QTL) -Kartierung unter Verwendung einer GGG-basierten genetischen Karte und der Methode ermöglichen Von Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9-basierte Gen-Bearbeitung. Der Ansatz der QTL-Abbildung erlaubt es, zu testen, ob eine Korrelation zwischen einer genomischen Region (en) und einem Phänotyp besteht. Es sind zwei Datensätze erforderlich, um einen QTL-Scan durchzuführen, eine genetische Karte, die auf der Nachkommenschaft eines rekombinanten Kreuzes basiert und ein quantifizierbarer Phänotyp, der in jedem der Nachkommen dieses Kreuzes beurteilt wird. Diese Datensätze werden dann so formatiert, dass sie mit einer R / qtl-Software kompatibel sind, die einen QTL-Scan erzeugt, um signifikante Loci zu identifizieren, die mit dem Phänotyp korreliert sind. Obwohl dies die Suche erheblich einschränken kannIndow von möglichen Kandidaten, QTLs Bereiche, die eine Reihe von Genen enthalten, aus denen das kausale Gen identifiziert werden muss. Nachdem WGS der Nachkommenschaft war entscheidend, um die kausale Arzneimittelresistenz Mutation auf der Gen-Ebene zu identifizieren. Einmal identifiziert, kann die Kandidaten-Mutation durch genetische Manipulation von medikamentenempfindlichen Parasiten verifiziert werden. Die einfachste und effizienteste Methode zur genetischen Veränderung von T. gondii ist das CRISPR / Cas9 System. Dieses System umfasste nur 2 Komponenten, die beide auf einem einzigen Plasmid codiert sind, eine einzelne Leitungs-RNA (gRNA), die eine 20 bp-Sequenz enthält, die komplementär zum genomischen Ziel ist, und die Cas9-Endonuklease, die einen doppelsträngigen DNA-Bruch (DSB) am Ziel erzeugt, Reparatur, die das Einfügen oder Löschen von Sequenzen um die Bruchstelle ermöglicht. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Verwendung von CRISPR / Cas9-basierten Genom-Editing-Tools, um das für die Sinefungin-Resistenz verantwortliche Gen zu überprüfen und transgene Parasiten zu konstruieren.
Introduction
Host-Bereich bestimmt das Ausmaß der Prävalenz einer Parasiten. Einige Parasiten haben sehr spezifische Host-Anforderungen, die den Bereich begrenzen, von dem sie gefunden werden, andere sind Generalisten. Ein solcher Generalist ist Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Dieser Parasit wird weltweit gefunden, da er alle Säugetiere und viele Vögel infizieren kann. Menschen sind auch anfällig und es wird geschätzt, dass etwa 1/3 der Weltbevölkerung infiziert wurde. Glücklicherweise kontrolliert eine robuste Immunantwort normalerweise das Wachstum des Parasiten, aber in Situationen, in denen das Immunsystem kompromittiert wird, kann der Parasit unkontrolliert wachsen und Krankheiten verursachen, oftmals Enzephalie. Auch dieser Parasit kann angeborene Krankheiten verursachen, wenn zuvor nicht infizierte Frauen während der Schwangerschaft infiziert sind, da ihnen das Immungedächtnis fehlt, um die Ausbreitung des Parasiten schnell zu begrenzen. Darüber hinaus gibt es eine Belastung der okulären Toxoplasmose, die zu Sehverlust führen kann 1 . Für diese reasoNs T. gondii hat sich zu einem Schwerpunkt der Studie, und aufgrund der vielen molekularen Methoden für seine Studie entwickelt, ein Modell für Apikomplexan Parasiten. Zwei Methoden, die hier diskutiert werden, sind Quantitative Trait Locus (QTL) Mapping und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9 Gen Editing. QTL-Mapping und CRISPR / Cas9-Bearbeitung sind jeweils Vorwärts- und Reverse-Gen-Ansätze, die in früheren Studien zur Identifizierung und / oder Charakterisierung von T. gondii- Virulenzgenen verwendet wurden. Hier werden diese Methoden kombiniert, um die Funktion eines Sinefunginresistenz- (SNF r ) -Gens, TgME49_290860, und seiner Orthologen (als SNR1 bezeichnet ) 2 zu identifizieren und zu bestätigen.
Obwohl T. gondii eine Vielzahl von Zwischenwirten infizieren kann, muss es die intestinalen Epithelzellen eines Felids durchlaufen und infizieren, um den Lebenszyklus abzuschließen. Katzen sind die endgültigen Gastgeber des Parasiten, wo die sEs werden exakte Stadien produziert und eine genetische Rekombination via Meiose auftritt. Um eine QTL-Studie durchzuführen, muss man ein genetisches Kreuz erzeugen, und im Falle von Toxoplasma bedeutet dies, dass zwei verschiedene Parasitenstämme passieren, die sich in einem phänotypischen Merkmal unterscheiden, die Elternflecken durch eine Katze, um rekombinante Nachkommen zu produzieren 3 . Bevor sie den Katzen zugeführt werden, werden die Elternstämme resistent gegen getrennte Medikamente, um eine effizientere Identifizierung von Rekombinanten durch doppelte Arzneimittelselektion der Nachkommenschaft zu ermöglichen. 4 Drei T-Shirts wurden zu diesem Zweck in T. gondii verwendet; Fluorodeoxyribose (FUDR), für die Uracil-Phosphoribosyltransferase ( UPRT ) das Resistenzgen 5 ist , Adenosin-Arabinosid (ARA), für das Adenosin-Kinase ( AK ) das Resistenzgen 6 ist , und Sinusfungin (SNF), für das das Resistenzgen unbekannt war 7 . Mehrere genetische Kreuze warenErstellt für T. gondii , aber nur die 24 Nachkommen des ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kreuz wurden mit der ganzen Genomsequenzierung (WGS) 8 genotypisiert. Dies eröffnete die Möglichkeit, das SNF-Resistenzgen unter Verwendung dieses Kreuzes zu markieren und zu identifizieren, da das VAND-Elternteil durch chemische Mutagenese des medikamentenempfindlichen VAND (VAND-SNFs) -Stammes Sinefungin resistent wurde und das VAND-Referenzgenom unter Verwendung des VAND- SNF s- Stamm, so dass die Identifizierung aller Polymorphismen zwischen der Nachkommenschaft WGS und dem VAND-SNF-Referenz-Genom, einschließlich der ererbten parenteralen VAND-SNF r Mutation, die einige der Nachkommen-Sinusfungin resistent gemacht.
Um den kausalen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) in der SNF r- Nachkommenschaft zu identifizieren, können mehrere rechnerbasierte Open-Source-Ressourcen verwendet werden, um die Daten zu analysieren. Um die genetische Karte für die ME49-FUDR r X VAND-SNF r überqueren die REDHORSE Software-Suite 9 wurde entwickelt, die WGS-Ausrichtungen der Eltern und Nachkommen verwendet, um genau die genomischen Positionen von genetischen Crossovers zu erkennen. Diese Abbildungsinformation kann dann mit den phänotypischen Daten (SNF r in der Nachkommenschaft) kombiniert werden, um einen mit dem 'qtl'-Paket 10 kompatiblen Datensatz in der R-statistischen Programmiersoftware zu formatieren, wo ein QTL-Scan ausgeführt werden kann, um signifikante Loci mit dem zu identifizieren Phänotyp Um das kausale SNP, das sich innerhalb des QTL-Locus befindet, zu identifizieren, kann das WGS-Liest der Nachkommenschaft individuell an das sinefunginempfindliche VAND-Genom mit dem Bowtie 2-Ausrichtungsprogramm 11 angepasst werden, aus dem SNPs mit dem VarScan mpileup2snp-Variantenaufrufprogramm 12 aufgerufen werden können. Mit diesen SNPs kann der QTL-Locus dann auf Polymorphismen gescannt werden, die im SNF r vorhanden sind, aber nichtIn der SNF-Nachkommenschaft. Mit dem in der kodierenden Region eines Gens identifizierten kausalen SNP kann die genetische Veränderung des Kandidaten-SNF- r- Gens in einem SNF- s- Stamm durchgeführt werden, um die Arzneimittelresistenzfunktion zu verifizieren.
Das CRISPR / Cas9-Genom-Editing-System wurde vor kurzem in Toxoplasma 13 etabliert , das wichtige Instrumente für die Erforschung der komplexen Biologie dieses Parasiten, insbesondere für genetische Studien in nicht-laborgerechten Stämmen, hinzugefügt hat. Aufgrund der hochaktiven nicht homologen Endverknüpfung (NHEJ) -Aktivität in WT- Toxoplasma- Zellen ist eine gezielte Genom-Modifikation schwer zu erreichen, da exogen eingeführte DNA zufällig in das Genom mit extrem hoher Frequenz 14 integriert wird . Um die Erfolgsrate der ortsspezifischen Modifikation zu erhöhen, wurden verschiedene Ansätze verwendet, um die Effizienz der homologen Rekombination zu erhöhen und / oder zu verringernE NHEJ Tätigkeit 15 , 16 . Eines dieser Ansätze ist das CRISPR / Cas9-System. Im Vergleich zu anderen Methoden ist das CRISPR / Cas9-System effizient bei der Einführung ortsspezifischer Modifikationen und ist einfach zu entwerfen 13 , 17 , 18 . Darüber hinaus kann es in jedem Toxoplasma- Stamm ohne zusätzliche Modifikation an den Parasiten 13 , 19 verwendet werden .
Das CRISPR / Cas9-System entstand aus dem adaptiven Immunsystem von Streptococcus pyogenes , das es verwendet, um die Invasion von mobilen genetischen Elementen wie Phagen 20 , 21 , 22 zu verteidigen. Dieses System nutzt das RNA-geführte DNA-Endonuklease-Enzym Cas9, um den doppelsträngigen DNA-Break (DSB) in das Target einzuführen, das anschließend repa istEntweder durch das fehleranfällige NHEJ, um Zielgene durch kurze Indelmutationen zu inaktivieren, oder durch Homologie gerichtete Rekombination, um den Zielort genau wie entworfen zu modifizieren 23 , 24 . Die Zielspezifität wird durch ein kleines RNA-Molekül namens Single Guide RNA (gRNA) bestimmt, das eine individuell gestaltete 20 nt Sequenz enthält, die 100% Homologie zur Ziel-DNA 22 hat . Das gRNA-Molekül enthält auch Signaturen, die von Cas9 erkannt werden, die die Nuklease zur Zielstelle führen, die ein spezielles Protospacer-benachbartes Motiv enthält (PAM, Sequenz ist 'NGG') 25 , 26 . Daher arbeiten das gRNA-Molekül und die PAM-Sequenz zusammen, um die Cas9-Schnittstelle im Genom zu bestimmen. Man kann leicht die gRNA-Sequenz ändern, um verschiedene Standorte für die Spaltung zu zielen.
Als das CRISPR / Cas9-System erstmals in Toxop entwickelt wurdeLasma, ein einzelnes Plasmid, das die Cas9-Nuklease exprimiert, und das gRNA-Molekül wurde verwendet, um DSB an der Zielstelle 13 , 17 einzuführen. Es wurde gezeigt, dass das CRISPR / Cas9-System die Effizienz der ortsspezifischen Genommodifikation nicht nur durch homologe Rekombination, sondern auch durch nicht homologe Integration exogener DNA 13 drastisch erhöht. Es tut dies in Wildtyp-Stämme, die NHEJ-Aktivität enthalten. Daher kann dieses System im Wesentlichen jedem Toxoplasma- Stamm für effiziente Genom-Bearbeitung verwendet werden. In einem typischen Experiment werden das zielspezifische CRISPR-Plasmid und das zur Modifizierung des Targets verwendete DNA-Fragment in Parasiten co-transfiziert. Wenn das zur Bestimmung des Targets verwendete DNA-Fragment homologe Sequenzen zum Zielort enthält, kann eine homologe Rekombination zur Reparatur des durch CRISPR / Cas9 eingeführten DSB verwendet werden, um eine präzise Modifikation des Targets zu ermöglichen. Auf der anderen Seite, wenn die intInduzierte DNA-Fragment enthält keine homologe Sequenz, sie kann noch in die CRISPR / Cas9-Targeting-Site integriert werden. Letztere wird häufig verwendet, um Gene durch Insertion von selektierbaren Markern zu stören oder Mutanten an Loci zu ergänzen, die eine negative Selektion erlauben 13 . Hier dient der SNR1- Locus als Beispiel, um zu zeigen, wie CRISPR / Cas9 für die Genunterbrechung und die Erzeugung von transgenen Parasiten verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Protokolle stellen mehrere Methoden vor, die, wenn sie kombiniert sind, die Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in T. gondii ermöglichen . Vor allem zwei waren integraler Bestandteil des Projektes, der relativ erfahrenen Methode der QTL-Kartierung und der kürzlich entwickelten Methode der CRISPR / Cas9-Genbearbeitung. Lander und Botstein veröffentlichten 1989 ihr einflussreiches Papier, das eine QTL-Kartierung zeigte, die genetische Loci mit Phänotypen korreliert 36 . In jüngster Zeit haben Dounda und Charpentier im Jahr 2012 das CRISPR / Cas9-Editing-System in Streptococcus pyogenes 22 beschrieben , das in vielen verschiedenen Modellen, wie zB T. gondii 13 , 17, als genetisches Werkzeug schnell angepasst wurde . Beide Methoden waren hier nützlich, wo QTL-Mapping den Locus definiert, der die Arzneimittelresistenzmutation enthielt, die letztlich mit der WGS-basierten SNP-Detektion identifiziert wurde, und die CRISPR / Cas9-Bearbeitung lieferte die ich Ans zu bestätigen, dass SNR1 das Sinefungin-Arzneimittelresistenzgen ist.
Die ME49-FUDR r X VAND-SNF r Kreuz 8 wurde ursprünglich entwickelt, um einen Virulenz-Phänotyp 19 zu verhören, aber die Elternstämme hatten auch einen zusätzlichen phänotypischen Unterschied, für den das kausale Gen nicht bekannt war, Sinefungin-Resistenz im VAND-Elternteil. Dies unterstreicht einen Vorteil von Kreuzen, dass sie wiederverwendet werden können, wenn zusätzliche phänotypische Unterschiede in den Eltern beobachtet werden. Dies war der Fall für ein weiteres Toxoplasma- Kreuz, Typ 2 x Typ 3, wo mehrere Gene, die an Virulenz beteiligt waren, durch die Abbildung mehrerer Phänotypen 37 , 38 , 39 , 40 gefunden wurden . Bisher wurden vier verschiedene T. gondii Kreuze beschrieben und verwendet, um Gene zu kennzeichnen, die für Phänotypen verantwortlich sindSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , die alle das Potenzial haben, wiederverwendet zu werden, um neue Phänotypen abzubilden, für die die genetische Basis unbekannt ist. Entlang dieser Linien wurden die Genome für 62 T. gondii- Stämme, die die bekannte globale genetische Diversität darstellen, sequenziert 43 . Neue Kreuze konnten aus diesem Pool für Stämme gemacht werden, die sich in interessanten Phänotypen unterscheiden. Nachdem ich die Vorteile der QTL-Kartierung gepriesen habe, muss man sagen, dass die Erzeugung eines Kreuzes kein geringfügiges Unternehmen ist. Es gibt andere Methoden, die verwendet werden können, um kausale Gene zu identifizieren. Eine leistungsstarke Technik nutzt die chemische Mutagenese, um Mutanten zu erzeugen, die auf Phänotypen untersucht werden können. Um das kausale Gen zu finden, können Mutanten entweder mit Cosmid-Bibliotheken 44 ergänzt werden oder Genom-Resequencing-Verfahren können verwendet werden, um die kausale Mutation zu finden. Für moSiehe hierzu zwei JoVE-Artikel von Coleman et al. Und Walwyn et al. Die diese Ansätze 46 , 47 skizzieren.
Viele der Schritte zur Identifizierung der kausalen SNF-Mutation (Protokolle 2 und 3) beruhen auf Rechenmethoden, die mit Software durchgeführt werden, die für den akademischen Gebrauch frei verfügbar ist. Detaillierte Befehle für jeden Schritt werden zur Verfügung gestellt und wenn mit den richtigen Dateien ausgeführt wird es dem Benutzer, die Datensätze neu zu erstellen, die notwendig sind, um den ursächlichen SNF r SNP zu finden. Denken Sie daran, dass einige der Syntax in den Befehlen auf Dateinamen oder Verzeichnisstruktur ($ PATH) verweisen, die auf die Benutzerpräferenz geändert werden können. Obwohl die hier angegebenen Befehle sicherlich nicht ausschließen, wie man ein Kreuz mit QTL-Analyse und WGS-basierter SNP-Identifikation analysieren kann, sind sie umfangreich genug, um das in diesem Artikel beschriebene Experiment zu wiederholen und es dem Benutzer zu ermöglichen, m zu werden Erz vertraut mit, wie diese Ansätze in einer Schritt-für-Schritt-Mode genutzt werden.
Obwohl QTL-Mapping und WGS-Sequenz-basierte SNP-Detektion ausreichend waren, um ein Kandidaten-SNF- r- Gen zu identifizieren, sind zusätzliche Experimente erforderlich, um seine Rolle in der Arzneimittelresistenz zu bestätigen. Dies kann durch Genunterbrechung oder Knockout-Techniken überzeugend gezeigt werden, die beide mit Hilfe von CRISPR / Cas9-Genbearbeitung erreicht werden können. Detaillierte Verfahren zur Verwendung von CRISPR / Cas9, um entweder Indel-Mutationen zu erzeugen oder transgene Konstrukte in ein Zielgen in T. gondii einzufügen, sind gegeben. Die Zielspezifität, die CRISPR / Cas9 bietet, erhöht die Effizienz der Genbearbeitung über traditionelle Methoden. Auch dies hat es effizienter ermöglicht, nicht-laborgerechte Stämme für genetische Untersuchungen zu verwenden, die bisher schwer zu modifizieren waren 13 . Obwohl in den Kinderschuhen CRISPR / Cas9 bereits verwendet wurde, um Genunterbrechungen zu machenLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , markieren Gene 17 und machen Gen-Knockouts 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 in T. gondii und versprechen, ein nützliches Werkzeug zu sein Für viele andere Studien in der Zukunft.
Die Entdeckung, dass die SNR1- Inaktivierung zu einer Sinefungin-Resistenz führt, macht den SNR1- Locus zu einer vielversprechenden Stelle für die Transgen-Insertion oder genetische Komplementierung. Um den Erfolg der Verwendung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Targeting zu maximieren, um die Integration von Transgen in den SNR1- Locus zu lenken , sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werdenRot während des experimentellen Designs. Zuerst wird empfohlen, ein Selektionsmarker in das transgene Konstrukt einzubeziehen, um die Effizienz der Dehnungskonstruktion zu erhöhen. Wenn ein Selektionsmarker enthalten ist, können sowohl positive als auch negative Selektion verwendet werden, was dazu führt, dass fast 100% der doppelt ausgewählten Parasiten mit dem im SNR1- Locus integrierten GOI transgen sind. Im Gegensatz dazu, wenn das transgene Konstrukt keine zusätzlichen auswählbaren Merkmale enthält und auf einer negativen Selektion am SNR1- Locus beruht , hängt die Effizienz der erfolgreichen Transgenese weitgehend von der Effizienz der Cotransfektion des CRISPR-Plasmids und des transgenen Konstrukts ab.
Zweitens, obwohl die CRISPR / Cas9-vermittelte ortsspezifische Integration eines nicht-homologen DNA-Fragments häufig zur Komplementierung und Transgenese verwendet wird, ist zu beachten, dass die Orientierung der Insertion in solchen Fällen nicht gewährleistet werden kann, dass entweder eine Richtung möglich ist. Dies kann sich als sinnvoll erweisenMs zu einigen Anwendungen. Zum Beispiel, um eine Mutante mit verschiedenen Gen-Allelen zu ergänzen, ist es schwierig, sicherzustellen, dass alle Allele in die gleiche Orientierung eingefügt werden, und Diskrepanzen in der Orientierung können Ausdrucksunterschiede verursachen. Für diese Art der Anwendung werden DNA-Konstrukte mit Sequenzen empfohlen, die homolog zum SNR1- Locus sind, was die richtige Integrationsorientierung antreibt ( Abbildung 6 ).
Drittens ist während der Transfektion das Verhältnis zwischen dem CRISPR-Plasmid und dem transgenen DNA-Molekül entscheidend für eine erfolgreiche transgene Dehnungskonstruktion. Dieses Verhältnis muss nach den Auswahlstrategien angepasst werden. Folgende Richtlinien werden empfohlen: 1) Wenn das transgene Konstrukt einen drogenresistenten Marker enthält und das entsprechende Medikament die einzige Selektion ist, die verwendet wird, um transgene Parasiten zu erzeugen, dh Sinefungin wird nicht verwendet, das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-PlasmaId ist 1: 5. Die Verwendung von mehr CRISPR-Plasmiden in diesem Fall erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Parasiten, die das transgene Konstrukt erhalten, auch das CRISPR-Plasmid erhalten werden, weshalb die Arzneimittelresistente Parasiten eher die Markierung an der CRISPR-Targeting-Stelle aufweisen. Wenn das Verhältnis umgekehrt ist, werden die meisten Parasiten, die das transgene Konstrukt erhalten, das CRISPR-Plasmid nicht erhalten. Infolgedessen erhält die überwiegende Mehrheit der drogenresistenten Parasiten das transgene Konstrukt durch zufällige Integration, die nicht mit der CRISPR / CAS9-vermittelten ortsspezifischen Insertion assoziiert ist. 2) Wenn das transgene Konstrukt einen drogenresistenten Marker enthält und das entsprechende Medikament zusammen mit Sinusfungin zur Selektion transgener Parasiten verwendet wird, beträgt das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-Plasmid 1: 1. Diese Strategie bietet die höchste Effizienz der transgenen Dehnungskonstruktion. 3) Wenn das transgene Konstrukt keinen selektierbaren Hersteller enthält, der sich auf eine negative Selektion stützt,Von Sinefungin allein, um transgene Parasiten zu erhalten, beträgt das vorgeschlagene Molverhältnis zwischen dem transgenen Konstrukt und dem CRISPR-Plasmid 5: 1. Die Begründung für dieses Design ist die gleiche wie in der ersten Leitlinie oben. Da sowohl Pyrimethamin als auch Sinusfungin zur Selektion in Protokoll 5 verwendet wurden, wurde das Verhältnis zwischen DHFR * mini Gen und dem SNR1 Targeting CRISPR Plasmid als 1: 1 eingestellt.
Zusammengenommen haben die hier skizzierten Methoden ein Detaillierungsgrad, das in der ursprünglichen Publikation, die SNR1 2 identifizierte, nicht möglich war. Diese Protokolle; Insbesondere die Kommandozeilen-Syntax, das sequentielle Layout der verwendeten Programme und die Verwendung von CRISPR / Cas9 sollten zukünftige Bemühungen unterstützen, neue Gene zu identifizieren, die für Phänotypen verantwortlich sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken L. David Sibley und Asis Khan für ihren Beitrag zur ursprünglichen Publikation, auf der diese Protokolle basieren. Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health gewährt AI108721 finanziert.
Materials
| T25 flasks | Corning | 430639 | |
| HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
| T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
| T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
| DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
| Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
| Syringe 10ml | BD | 309604 | |
| Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
| Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
| Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
| Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
| R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
| Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
| NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
| SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
| VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
| MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
| pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
| pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
| pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
| L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
| Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
| Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
| 6-well TC plate | Corning | 353046 | |
| 24-well TC plate | Corning | 353935 | |
| Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
| 96-well TC plate | Corning | 353075 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |
References
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