Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
Des détails sont présentés sur la façon dont le cartographie QTL avec une carte génétique basée sur la séquence génomique complète peut être utilisé pour identifier un gène de résistance aux médicaments chez Toxoplasma gondii et comment cela peut être vérifié avec le système CRISPR / Cas9 qui modifie efficacement une cible génomique, dans ce cas le Gène de résistance aux médicaments.
Abstract
Le savoir scientifique est intrinsèquement lié aux technologies et méthodes disponibles. Cet article présentera deux méthodes permettant l'identification et la vérification d'un gène de résistance aux médicaments dans le parasite d'Apicomplexan Toxoplasma gondii , la méthode de la cartographie quantitative des locus de traits (QTL) en utilisant une carte génétique à base de séquences de génome entier (WGS) et la méthode Des répétitions palindromiques courtes clivées périodiquement et sans palpage (CRISPR) / Cas9. L'approche de la cartographie QTL permet de tester s'il existe une corrélation entre une (des) région (s) génomique (s) et un phénotype. Deux ensembles de données sont nécessaires pour exécuter une analyse QTL, une carte génétique basée sur la descendance d'une croix recombinante et un phénotype quantifiable évalué dans chacune des progénitures de cette croix. Ces ensembles de données sont ensuite formatés pour être compatibles avec le logiciel R / qtl qui génère une analyse QTL pour identifier des loci significatifs corrélés avec le phénotype. Bien que cela puisse considérablement réduire la recherche wEn ce qui concerne les candidats possibles, les QTL couvrent des régions contenant un certain nombre de gènes à partir desquels le gène causal doit être identifié. L'obtention de WGS de la progéniture était critique pour identifier la mutation de la résistance aux médicaments causale au niveau du gène. Une fois identifié, la mutation candidate peut être vérifiée par la manipulation génétique de parasites sensibles aux médicaments. La méthode la plus facile et efficace pour modifier génétiquement T. gondii est le système CRISPR / Cas9. Ce système comprenait seulement 2 composants codés sur un seul plasmide, un ARN guide unique (gRNA) contenant une séquence de 20 pb complémentaire de la cible génomique et l'endonucléase Cas9 qui génère une rupture d'ADN double brin (DSB) à la cible, Dont la réparation permet l'insertion ou la suppression de séquences autour du site de rupture. Cet article fournit des protocoles détaillés pour utiliser les outils d'édition du génome basés sur CRISPR / Cas9 pour vérifier le gène responsable de la résistance au sinefungine et pour construire des parasites transgéniques.
Introduction
La gamme hôte détermine l'étendue de la prévalence d'un parasite. Certains parasites ont des exigences d'hôte très spécifiques qui limitent la zone à partir de laquelle ils se trouvent, d'autres sont des généralistes. Un tel généraliste est Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Ce parasite se trouve dans le monde entier car il peut infecter tous les mammifères et beaucoup d'oiseaux. Les humains sont également sensibles et on estime qu'environ 1/3 de la population mondiale a été infectée. Heureusement, une réponse immunitaire robuste contrôle normalement la croissance du parasite, mais dans les situations où le système immunitaire est compromis, le parasite peut se détériorer et causer des maladies souvent encéphaliques. En outre, ce parasite peut causer des maladies congénitales si les femmes précédemment non infectées sont infectées pendant la grossesse car elles manquent de mémoire immunitaire pour limiter rapidement la propagation du parasite. En outre, il existe un fardeau de toxoplasmose oculaire qui peut entraîner une perte de vision 1 . Pour ces reasoNs T. gondii est devenu un centre d'étude, et en raison des nombreuses méthodes moléculaires développées pour son étude, un modèle pour les parasites Apicomplexan. Deux méthodes qui seront discutées ici sont le cartographage quantitatif de Locus de traçabilité (QTL) et l'édition de gènes Palindromic court (CRISPR) / Cas9 régulière à l'intersection clusterisée. La cartographie QTL et l'édition CRISPR / Cas9 sont, respectivement, des approches génétiques avancées et inversées qui ont été utilisées dans des études antérieures pour identifier et / ou caractériser les gènes de virulence de T. gondii . Ici, ces méthodes sont combinées pour identifier et confirmer la fonction d'un gène de résistance à la sinefungine (SNF r ), TgME49_290860 et ses orthologues (annoté comme SNR1 ) 2 .
Bien que T. gondii puisse infecter une grande variété d'hôtes intermédiaires, il doit traverser et infecter les cellules épithéliales intestinales d'un felid pour compléter le cycle de vie. Les chats sont les hôtes définitifs du parasite où le sDes étapes exotiques sont produites et une recombinaison génétique par méiose se produit. Pour mener une étude QTL, il faut créer une croix génétique, et dans le cas de Toxoplasma, cela signifie passer deux souches de parasites différentes qui diffèrent selon un trait phénotypique, les taches parentales, à travers un chat pour produire une descendance recombinante 3 . Avant d'être administrés aux chats, les souches parentales sont résistantes aux médicaments séparés pour permettre une identification plus efficace des recombinants par double choix de médicaments de la progéniture 4 . Trois médicaments ont été utilisés à T. gondii à cette fin; Fluorodéoxyribose (FUDR) pour lequel l'uracile phosphoribosyl transférase ( UPRT ) est le gène de résistance 5 , l'arabinoside d'adénosine (ARA) pour lequel l'adénosine kinase ( AK ) est le gène de résistance 6 et la sinefungine (SNF) pour laquelle le gène de résistance était inconnu 7 . Plusieurs croisements génétiques ont étéCréé pour T. gondii , mais seulement la descendance 24 de la croix ME49-FUDR r X VAND-SNF r ont été gènes en utilisant le séquençage du génome complet (WGS) 8 . Cela a ouvert la possibilité de cartographier et d'identifier le gène de résistance SNF en utilisant cette croix car le parent VAND a été rendu résistant à la sinefungine par mutagenèse chimique de la souche VAND (VAND-SNF s ) sensible au médicament et le génome de référence VAND a été séquencé en utilisant le VAND- La souche de SNF permettant ainsi l'identification de tous les polymorphismes entre la progéniture WGS et le génome de référence de VAND-SNF, y compris la mutation VAND-SNF r parentale héréditaire qui a rendu une partie de la progéniture résistante à la sinefungine.
Afin d'identifier le polynucléaire causal de nucléotide unique (SNP) dans la descendance SNF r , plusieurs ressources open source à base de calcul peuvent être utilisées pour analyser les données. Pour créer la carte génétique pour le ME49-FUDR r X VAND-SNF r travers la suite de logiciel REDHORSE 9 a été développé qui utilise les alignements WGS des parents et des descendants pour détecter avec précision les positions génomiques des croisements génétiques. Cette information de cartographie peut ensuite être combinée avec les données phénotypiques (SNF r dans la progéniture) pour formater un ensemble de données compatible avec le paquet 'qtl' 10 dans le logiciel de programmation statistique R où un balayage QTL peut être exécuté pour révéler des loci significatifs corrélés avec Phénotype. Pour identifier le SNP causal situé dans le locus QTL, les lectures WGS de la progéniture peuvent être alignées individuellement avec le génome VAND sensible à la sinefungine en utilisant le programme d'alignement Bowtie 2 11 dont les SNP peuvent être appelés en utilisant le programme d'appelant variant VarScan mpileup2snp 12 . En utilisant ces SNP, le locus QTL peut ensuite être analysé pour les polymorphismes présents dans le SNF r mais pasDans la descendance SNF s . Avec le SNP causal identifié dans la région codante d'un gène, la modification génétique du gène candidat SNF r peut être effectuée dans une souche SNF pour vérifier la fonction de résistance aux médicaments.
Le système de modification du génome CRISPR / Cas9 a récemment été créé dans Toxoplasma 13 , qui a ajouté d'importants outils pour l'exploration de la biologie complexe de ce parasite, en particulier pour les études génétiques dans des souches non adaptées au laboratoire. En raison de l'activité hautement active de liaison non homologue (NHEJ) dans les cellules WT Toxoplasma , la modification ciblée du génome est difficile à réaliser car l'ADN introduit de manière exogène est intégré de manière aléatoire au génome à une fréquence extrêmement élevée 14 . Pour augmenter le taux de réussite de la modification spécifique du locus, différentes approches ont été utilisées pour augmenter l'efficacité de la recombinaison homologue et / ou diminuerE activité NHEJ 15 , 16 . L'une de ces approches est le système CRISPR / Cas9. Par rapport à d'autres méthodes, le système CRISPR / Cas9 est efficace pour introduire des modifications spécifiques au site et est facile à concevoir 13 , 17 , 18 . En outre, il peut être utilisé dans n'importe quelle souche Toxoplasma sans modification supplémentaire du parasite 13 , 19 .
Le système CRISPR / Cas9 provient du système immunitaire adaptatif de Streptococcus pyogenes qui l'utilise pour défendre l'invasion d'éléments génétiques mobiles tels que les phages 20 , 21 , 22 . Ce système utilise l'enzyme d'endonucléase d'ADN guidée par l'ARN Cas9 pour introduire une rupture d'ADN à double brin (DSB) dans la cible, qui est par la suite réparéeEmmenés soit par le NHEJ propice aux erreurs pour inactiver les gènes cibles à travers de courtes mutations d'indel, soit par recombinaison dirigée par homologie pour modifier le locus cible exactement comme conçu 23 , 24 . La spécificité cible est déterminée par une petite molécule d'ARN appelée RNA à guide unique (gRNA), qui contient une séquence de 20 nt conçue individuellement qui a 100% d'homologie avec l'ADN cible 22 . La molécule de gRNA contient également des signatures reconnues par Cas9 qui guident la nuclease vers le site cible, qui comprend un Motif adjacent Protospacer Adjacent (PAM, séquence 'NGG') 25 , 26 . Par conséquent, la molécule d'ARNp et la séquence PAM fonctionnent ensemble pour déterminer le site de clivage Cas9 dans le génome. On peut facilement changer la séquence de gRNA pour cibler différents sites pour le clivage.
Lorsque le système CRISPR / Cas9 a d'abord été développé dans ToxopLasma, un plasmide unique exprimant la nucléase Cas9 et la molécule d'ARNp a été utilisé pour introduire DSB au site de ciblage 13 , 17 . Il a été démontré que le système CRISPR / Cas9 augmente considérablement l'efficacité de la modification du génome spécifique au site, non seulement par recombinaison homologue, mais aussi par intégration non homologue de l'ADN exogène 13 . Il le fait dans des souches de type sauvage qui contiennent de l'activité NHEJ. Par conséquent, ce système peut être utilisé dans essentiellement n'importe quelle souche Toxoplasma pour l'édition efficace du génome. Dans une expérience typique, le plasmide CRISPR cible spécifique et le fragment d'ADN utilisé pour modifier la cible sont co-transfectés en parasites. Si le fragment d'ADN utilisé pour modifier la cible contient des séquences homologues sur le locus cible, une recombinaison homologue peut être utilisée pour réparer le DSB introduit par CRISPR / Cas9 pour permettre une modification précise de la cible. D'autre part, si l'intLe fragment d'ADN irradié ne contient pas de séquence homologue, il peut encore être intégré dans le site de ciblage CRISPR / Cas9. Ce dernier est souvent utilisé pour perturber les gènes par l'insertion de marqueurs sélectionnables ou pour compléter les mutants chez les loci qui permettent une sélection négative 13 . Ici, le locus SNR1 sert d'exemple pour montrer comment CRISPR / Cas9 peut être utilisé pour la perturbation des gènes et la génération de parasites transgéniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces protocoles présentent plusieurs méthodes qui, lorsqu'elles sont combinées, permettent d'identifier un gène de résistance aux médicaments chez T. gondii . Deux en particulier étaient une partie intégrante du projet, la méthode relativement saisonnée de la cartographie QTL et la méthode récemment développée de l'édition de gènes CRISPR / Cas9. Lander et Botstein ont publié leur document influent en 1989 démontrant la cartographie QTL qui corrèle les loci génétiques avec les phénotypes 36 . Plus récemment en 2012, Dounda et Charpentier ont décrit le système d'édition CRISPR / Cas9 dans Streptococcus pyogenes 22 qui a été rapidement adapté comme outil génétique dans de nombreux modèles différents, y compris T. gondii 13 , 17 . Les deux méthodes étaient utiles ici, où la cartographie QTL définissait le locus contenant la mutation de la résistance aux médicaments qui a finalement été identifiée à l'aide de la détection SNP basée sur WGS, et l'édition CRISPR / Cas9 m'a fourni Et confirmer que SNR1 est le gène de résistance aux médicaments de sinefungine.
Le ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8 a d'abord été développé pour interroger un phénotype de virulence 19 , mais les souches parentales ont également une différence phénotypique supplémentaire pour laquelle le gène causal n'était pas connu, la résistance au sinefungine chez le parent VAND. Cela met en évidence un avantage des croisements dans la mesure où ils peuvent être réorientés lorsque des différences phénotypiques supplémentaires chez les parents sont observées. C'est le cas pour une autre Toxoplasma cross, type 2 x type 3, où plusieurs gènes impliqués dans la virulence ont été trouvés en cartographiant de multiples phénotypes 37 , 38 , 39 , 40 . À ce jour, quatre croisements différents de T. gondii ont été décrits et utilisés pour cartographier les gènes responsables des phénotypesSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , tous pouvant être réutilisés pour cartographier de nouveaux phénotypes pour lesquels la base génétique est inconnue. Dans ce sens, les génomes pour 62 souches de T. gondii représentant la diversité génétique mondiale connue ont été séquencés 43 . On pourrait créer de nouveaux croisements à partir de ce bassin pour les souches qui diffèrent selon les phénotypes intéressants. Après avoir exhorté les avantages de la cartographie QTL, il faut dire que générer une croix n'est pas une entreprise mineure. D'autres méthodes peuvent être utilisées pour identifier les gènes causaux. Une technique puissante utilise la mutagenèse chimique pour créer des mutants qui peuvent être criblés pour les phénotypes. Pour trouver le gène causal, les mutants peuvent soit être complétés avec des bibliothèques cosmiques 44, soit des méthodes de reséquencement du génome peuvent être utilisées pour trouver la mutation causale 45 . Pour le moisRe sur ceci, voir deux articles JoVE de Coleman et al. Et Walwyn et al. Qui décrivent ces approches 46 , 47 .
Beaucoup des étapes menant à l'identification de la mutation SNF causale (Protocoles 2 et 3) reposent sur des méthodes de calcul réalisées avec des logiciels disponibles gratuitement pour un usage académique. Des commandes détaillées pour chaque étape sont fournies et, lorsqu'elles sont exécutées avec les fichiers appropriés, permettront à l'utilisateur de recréer les jeux de données nécessaires pour trouver SNF causal SNP. Gardez à l'esprit qu'une partie de la syntaxe des commandes fait référence aux noms de fichiers ou à la structure du répertoire ($ PATH) qui peuvent être modifiés selon la préférence de l'utilisateur. Bien que les commandes données ici n'exécutent certainement pas les moyens d'analyser une croix avec l'analyse QTL et l'identification SNP basée sur WGS, elles sont suffisamment complètes pour répéter l'expérience décrite dans cet article et devraient permettre à l'utilisateur de devenir m Il est familier avec la façon dont ces approches sont utilisées de façon étape par étape.
Bien que la cartographie QTL et la détection SNP basée sur la séquence WGS soient suffisantes pour identifier un gène candidat SNF r , des expériences supplémentaires sont nécessaires pour confirmer son rôle dans la résistance aux médicaments. Cela peut être démontré de manière convaincante par des techniques de perturbation des gènes ou de knock-out, qui peuvent être réalisées à l'aide de l'édition de gènes CRISPR / Cas9. Des méthodes détaillées pour utiliser CRISPR / Cas9 pour générer des mutations indel ou insérer des constructions transgéniques dans un gène cible dans T. gondii sont données. La spécificité de ciblage que CRISPR / Cas9 fournit augmente l'efficacité de l'édition de gènes par rapport aux méthodes traditionnelles. En outre, cela a augmenté efficacement, a permis d'utiliser des souches non adaptées au laboratoire pour des études génétiques qui étaient auparavant difficiles à modifier 13 . Bien que dans son enfance, CRISPR / Cas9 ait déjà été utilisé pour provoquer des perturbations génétiquesLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , marquez les gènes 17 , et créez les gènes nœuds 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 dans T. gondii , promettant d'être un outil utile Pour de nombreuses autres études à l'avenir.
La découverte que l'inactivation de SNR1 entraîne une résistance au sinefungine rend le locus SNR1 un site prometteur pour l'insertion de transgène ou la complémentation génétique. Pour maximiser le succès de l'utilisation du ciblage génétique médié par CRISPR / Cas9 pour diriger l'intégration du transgène dans le locus SNR1 , les aspects suivants devraient être considérésRouge lors de la conception expérimentale. Tout d'abord, un marqueur de sélection est recommandé d'être inclus dans la construction transgénique pour augmenter l'efficacité de la construction des contraintes. Si un marqueur de sélection est inclus, on peut utiliser une sélection positive et négative, ce qui donne à 100% des parasites doublement sélectionnés transgéniques avec le GOI intégré au locus SNR1 . En revanche, si la construction transgénique ne contient pas d'autres traits sélectionnables et repose sur une sélection négative au niveau du locus SNR1 , l'efficacité de la transgénèse réussie dépend en grande partie de l'efficacité de la co – transfection du plasmide CRISPR et de la construction transgénique.
Deuxièmement, bien que l'intégration spécifique au site médiée par CRISPR / Cas9 d'un fragment d'ADN non homologue soit fréquemment utilisée pour la complémentation et la transgenèse, il convient de noter que l'orientation de l'insertion ne peut être garantie dans les cas où l'une ou l'autre direction est possible. Cela peut poser problèmeMs à certaines applications. Par exemple, pour compléter un mutant avec des allèles de gènes différents, il est difficile de s'assurer que tous les allèles sont insérés dans la même orientation et que les divergences d'orientation peuvent entraîner des différences d'expression. Pour ce type d'application, des constructions d'ADN avec des séquences homologues au locus SNR1 sont recommandées, ce qui entraînera une orientation d'intégration appropriée ( Figure 6 ).
Troisièmement, pendant la transfection, le rapport entre le plasmide CRISPR et la molécule d'ADN transgénique est essentiel pour la construction de contraintes transgéniques réussies. Ce ratio doit être ajusté en fonction des stratégies de sélection. Les recommandations suivantes sont recommandées: 1) Si la construction transgénique contient un marqueur résistant aux médicaments et que le médicament correspondant est la seule sélection utilisée pour générer des parasites transgéniques, c'est-à – dire que la sinefungine n'est pas utilisée, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPRId est 1: 5. L'utilisation de plus de plasmide CRISPR dans ce cas augmente la probabilité que les parasites recevant la construction transgénique recevront également le plasmide CRISPR, donc les parasites résistant aux médicaments sont plus susceptibles d'avoir le marqueur inséré au site de ciblage CRISPR. Si le rapport est inversé, la plupart des parasites qui reçoivent la construction transgénique n'obtiendront pas le plasmide CRISPR. En conséquence, la grande majorité des parasites résistants aux médicaments obtiennent la construction transgénique par intégration aléatoire non associée à une insertion spécifique au site médiée par CRISPR / CAS9. 2) Si la construction transgénique contient un marqueur résistant aux médicaments et que le médicament correspondant est utilisé avec la sinefungine pour sélectionner des parasites transgéniques, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPR est de 1: 1. Cette stratégie offre la plus grande efficacité de la construction des contraintes transgéniques. 3) Si la construction transgénique ne contient pas de fabricant sélectionnable, en s'appuyant sur une sélection négativePar la sinefungin seule pour obtenir des parasites transgéniques, le rapport molaire suggéré entre la construction transgénique et le plasmide CRISPR est de 5: 1. La raison d'être de cette conception est la même que dans la première ligne directrice ci-dessus. Puisque la pyriméthamine et la sinefungine ont été utilisées pour la sélection dans le Protocole 5, le rapport entre le mini gène DHFR * et le plasmide CRISPR ciblant SNR1 a été fixé à 1: 1.
Ensemble, les méthodes décrites ici ont un niveau de détail qui n'a pas été possible de transmettre dans la publication originale qui a identifié SNR1 2 . Ces protocoles; En particulier, la syntaxe de la ligne de commande, la mise en page séquentielle des programmes utilisés et l'utilisation de CRISPR / Cas9 devraient aider les efforts futurs pour identifier les nouveaux gènes responsables des phénotypes.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier L. David Sibley et Asis Khan pour leur contribution à la publication originale sur laquelle ces protocoles sont basés. Ce travail a été financé par la subvention AL108721 des instituts nationaux de la santé.
Materials
| T25 flasks | Corning | 430639 | |
| HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
| T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
| T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
| DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
| Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
| Syringe 10ml | BD | 309604 | |
| Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
| Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
| Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
| Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
| R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
| Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
| NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
| SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
| VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
| MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
| pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
| pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
| pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
| L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
| Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
| Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
| 6-well TC plate | Corning | 353046 | |
| 24-well TC plate | Corning | 353935 | |
| Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
| 96-well TC plate | Corning | 353075 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |
References
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