كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في<em> التوكسوبلازما غونديي</em
Summary
وترد تفاصيل عن كيفية رسم الخرائط كتل مع تسلسل الجينوم تسلسل الجينوم بأكمله يمكن استخدامها لتحديد الجينات المقاومة للأدوية في توكسوبلاسما غونديي وكيف يمكن التحقق من ذلك مع نظام كريسبر / Cas9 التي تعدل بكفاءة الهدف الجيني، في هذه الحالة الجينات المقاومة للمخدرات.
Abstract
ترتبط المعرفة العلمية ارتباطا جوهريا بالتكنولوجيات والأساليب المتاحة. ستقدم هذه المقالة طريقتين تسمحان بالتحديد والتحقق من جينات مقاومة للأدوية في طفيلي أبيكومبلكسان توكسوبلاسما غونديي ، طريقة رسم خريطة الكميات الكمية (كتل) باستخدام الخريطة الوراثية المستندة إلى الجينوم (وس)، والطريقة من متفاوتة منتظمة منتظمة متداخلة قصيرة متناظرة (كريسبر) / Cas9 القائم على تحرير الجينات. النهج من كتل رسم الخرائط يسمح واحد لاختبار ما إذا كان هناك علاقة بين المنطقة الجينية (ق) والنمط الظاهري. هناك حاجة إلى مجموعتين من البيانات لتشغيل مسح كتل، وهي خريطة وراثية تستند إلى سلالة الصليب المؤتلف ونمط ظاهري قابل للقياس يتم تقييمه في كل من سلالة هذا الصليب. ثم يتم تنسيق مجموعات البيانات هذه لتكون متوافقة مع برنامج R / كتل الذي يولد مسح كتل لتحديد ارتباط كبير مع النمط الظاهري. على الرغم من أن هذا يمكن أن يضييق كثيرا البحث ثمن بين المرشحين المحتملين، كتلس تمتد المناطق التي تحتوي على عدد من الجينات التي الجينات السببية تحتاج إلى تحديد. وكان وجود وس من سلالة حاسمة لتحديد الطفرة المقاومة للمخدرات السببية على مستوى الجينات. وبمجرد تحديدها، يمكن التحقق من طفرة مرشح عن طريق التلاعب الجيني من الطفيليات الحساسة المخدرات. الأسلوب الأكثر سهولة وكفاءة لتعديل وراثيا T. غونديي هو نظام كريسبر / Cas9. يتكون هذا النظام من مكونين فقط مشفرين على بلازميد واحد، و رنا دليل واحد (غرنا) يحتوي على تسلسل 20 بب مكمل للهدف الجيني و إندوسلياز Cas9 الذي يولد كسر الحمض النووي المزدوج حبلا (دسب) في الهدف، إصلاح الذي يسمح لإدراج أو حذف تسلسل حول موقع الكسر. توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لاستخدام كريسبر / Cas9 استنادا إلى أدوات التحرير الجينوم للتحقق من الجين المسؤول عن المقاومة سينفونجين وبناء الطفيليات المعدلة وراثيا.
Introduction
نطاق المضيف يحدد مدى انتشار الطفيليات. بعض الطفيليات لديها متطلبات محددة جدا المضيف الذي يحد من المنطقة التي تم العثور عليها، والبعض الآخر من العموميين. واحد من هذا القائد هو توكسوبلاسما غونديي ( T. غونديي) . تم العثور على هذا الطفيلي في جميع أنحاء العالم لأنها يمكن أن تصيب جميع الثدييات والعديد من الطيور. البشر هم أيضا عرضة، ويقدر أن ما يقرب من 1/3 من سكان العالم قد أصيبوا. لحسن الحظ، استجابة مناعية قوية تسيطر عادة على نمو الطفيلي، ولكن في الحالات التي يتعرض فيها الجهاز المناعي للخطر الطفيلي يمكن أن تنمو دون رادع وتسبب الأمراض، وغالبا ما الدماغية. كما أن هذا الطفيلي يمكن أن يسبب أمراض خلقية إذا أصيبت النساء اللاتي لم يصبن بهن أثناء الحمل حيث يفتقرن إلى الذاكرة المناعية للحد من انتشار الطفيلي بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، هناك عبء داء المقوسات العين التي يمكن أن تؤدي إلى فقدان البصر 1 . لهذه رياسوأصبح نس T. غونديي محور الدراسة، وبسبب العديد من الأساليب الجزيئية المتقدمة لدراستها، نموذجا للطفيليات أبيكومبلكسان. هناك طريقتان ستتم مناقشتهما هنا هي رسم الخرائط الكمية لوكاتوس (كتل) وتجمعاتها المتداخلة المتداخلة بشكل منتظم (كريسر) / تحرير الجين Cas9. كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 التحرير هي، على التوالي، والنهج الجينية إلى الأمام والعكس التي استخدمت في الدراسات السابقة لتحديد و / أو توصيف الجينات الفوعة T. غونديي . هنا، يتم الجمع بين هذه الطرق لتحديد وتأكيد وظيفة سينفونجين المقاومة (الجينات شنف) الجين، TgME49_290860، و أورثولوغس (المشروح كما SNR1 ) 2 .
على الرغم من أن T. غونديي يمكن أن تصيب مجموعة واسعة من المضيفين وسيطة، يجب أن تمر من خلال إصابة الخلايا الظهارية في الأمعاء من الجنين لإكمال دورة الحياة. القطط هي المضيفين النهائي للطفيلي حيث sيتم إنتاج المراحل الخارجية وإعادة التركيب الجيني عن طريق الانقسام الاختزالي يحدث. لإجراء دراسة كتل يجب على المرء أن ينشئ تعبيرا وراثيا، وفي حالة التوكسوبلازما يعني ذلك تمرير سلالتين مختلفتين من الطفيليات تختلف في سمة ظاهرية، البقع الوالدية، من خلال القط لإنتاج النسل المؤتلف 3 . قبل أن يتغذى على القطط، يتم إجراء سلالات الأبوية مقاومة للأدوية منفصلة للسماح لتحديد أكثر كفاءة من ريكومبينانتس عن طريق اختيار المخدرات مزدوجة من سلالة 4 . وقد استخدمت ثلاثة أدوية في T. غونديي لهذا الغرض؛ فلوروديوكسيريبوس (فودر) الذي هو أوراسيل فوسفهريبوسيل ترانسفيراز ( أوبرت ) هو الجينات المقاومة 5 ، أدينوسين أرابينوسيد (أرا) الذي أدينوسين كيناز ( أك ) هو الجينات المقاومة 6 ، و سينفونجين (شنف) الذي كان الجين المقاومة غير معروف 7 . وكانت العديد من الصلبان الوراثيةتم إنشاؤها ل T. غونديي ، ولكن فقط سلالة 24 من ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب تم تنميط الجيني باستخدام تسلسل الجينوم كله (وس) 8 . وهذا فتح إمكانية رسم الخرائط وتحديد الجينات المقاومة شنف باستخدام هذا الصليب كما تم جعل الوالد فاند مقاومة سينفونجين عن طريق الطفرات الكيميائية من سلالة فاند-فند-شنف المخدرات الحساسة، وجينوم مرجع فاند تم تسلسل باستخدام VAND- وبالتالي فإن سلالة ال شنف تسمح بتحدید جمیع التشکیلات المتعددة بین وس وسلف و الجینوم المرجعي ل فاند-سنف، بما في ذلك الطفرات الموروثة فاند-سنف الوالدیة التي جعلت بعض من سلالة سینفونجین مقاومة.
من أجل التعرف على تعدد الأشكال النيوكليوتيدات السببية (سنب) في نسل ص نسل، ويمكن استخدام العديد من المصادر المفتوحة المصدر حسابية لتحليل البيانات. لإنشاء الخريطة الوراثية ل ME49-فودر ص X فاند-شنف ص عبر ريدهورس تم تطوير البرنامج 9 المجموعة التي تستخدم التحالفات وس من الآباء والأمهات والنسل للكشف بدقة المواقف الجينومية من عمليات الانتقال الجيني. ويمكن بعد ذلك الجمع بين هذه المعلومات الخرائط مع البيانات المظهرية (شنف ص في النسل) لتنسيق مجموعة بيانات متوافقة مع حزمة 'كتل' 10 في برنامج البرمجة الإحصائية R حيث يمكن إجراء مسح كتل للكشف عن مكان كبير مرتبط مع النمط الظاهري. لتحديد سنب السببية تقع داخل موضع كتل، وقراءة وس من سلالة يمكن أن تكون محاذاة بشكل فردي إلى جينومونجين الجينوم فاند الحساسة باستخدام برنامج المحاذاة بووتي 2 11 التي يمكن أن يسمى سنبس باستخدام برنامج المتصل البديل mpileup2snp فارسكان 12 . باستخدام هذه الأشكال، يمكن بعد ذلك فحص مكان كتل من أجل تعدد الأشكال الموجودة في شنف r ولكن ليسفي ذرية ال [سنف]. مع سنب السببية التي تم تحديدها في منطقة الترميز من الجينات، والتعديل الوراثي للجين مرشح شنف R يمكن أن يؤديها في سلالة شنف للتحقق من وظيفة مقاومة المخدرات.
وقد تم مؤخرا إنشاء نظام تحرير الجينوم كريسبر / Cas9 في توكسوبلاسما 13 ، التي أضافت أدوات هامة لاستكشاف بيولوجيا معقدة من هذا الطفيلي، وخاصة للدراسات الجينية في سلالات غير المختبر تكييفها. بسبب نشاط غير متناظرة للغاية الانضمام (نهيج) النشاط في خلايا توكسوبلازما وت، تعديل الجينوم المستهدفة من الصعب تحقيق منذ دنا تم إدخالها بشكل خارجي يتم دمجها بشكل عشوائي إلى الجينوم في وتيرة عالية للغاية 14 . لزيادة معدل نجاح تعديل محدد الموضع، وقد استخدمت نهج مختلفة لزيادة كفاءة إعادة التركيب مثلي و / أو خفض ثنشاط نهيج 15 ، 16 . واحد من هذه النهج هو نظام كريسبر / Cas9. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن نظام كريسبر / Cas9 فعال في إدخال تعديلات خاصة بالموقع ويسهل تصميمها 13 و 17 و 18 . وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن استخدامها في أي سلالة التوكسوبلازما دون تعديل إضافي للطفيلي 13 ، 19 .
نظام كريسبر / Cas9 نشأ من نظام المناعة التكيفية من العقدية بيوجينيس ، والذي يستخدم للدفاع عن غزو العناصر الوراثية المتنقلة مثل فاجيس 20 ، 21 ، 22 . يستخدم هذا النظام الحمض النووي الريبي الحمض النووي الموجهة إنزيم انزيم Cas9 لإدخال مزدوج حبلا كسر الحمض النووي (دسب) في الهدف، والذي هو في وقت لاحق ريباإريد إما من قبل نيج عرضة للخطر لتعطيل الجينات المستهدفة من خلال طفرات إندل قصيرة، أو عن طريق التناظر توجيه إعادة التركيب لتغيير موضع الهدف بالضبط كما صممت 23 ، 24 . يتم تحديد خصوصية الهدف من قبل جزيء الحمض النووي الريبي صغير يدعى رنا دليل واحد (غرنا)، والذي يحتوي على تصميم 20 نت التسلسل بشكل فردي يحتوي على 100٪ التماثل إلى الحمض النووي الهدف 22 . يحتوي جزيء الحمض الريبي النووي النقال أيضا على التواقيع المعترف بها من قبل Cas9 التي توجه نوكلياز إلى الموقع المستهدف، والذي يتضمن بروتوسباسر المتاخمة العزر خاص (بام، تسلسل هو 'نغ') 25 ، 26 . ولذلك، فإن جزيء الحمض النووي الريبي وتسلسل بام تعمل معا لتحديد موقع الانقسام Cas9 في الجينوم. يمكن للمرء بسهولة تغيير تسلسل الحمض النووي الريبي لاستهداف مواقع مختلفة للانقسام.
عندما تم تطوير نظام كريسر / Cas9 لأول مرة في توكسوبلاسما، واحد البلازميد معربا عن نوكلياز Cas9 وجزيء الحمض الريبي النووي النقال استخدمت لإدخال دسب في موقع الاستهداف 13 ، 17 . وقد تبين أن نظام كريسبر / Cas9 يزيد بشكل كبير من كفاءة تعديل الجينوم موقع معين، وليس فقط عن طريق إعادة التركيب مثلي، ولكن أيضا التكامل غير متماثل من الحمض النووي خارجي 13 . يفعل ذلك في سلالات ويلديب التي تحتوي على نشاط نهيج. ولذلك، يمكن استخدام هذا النظام في الأساس أي سلالة التوكسوبلازما لتحرير الجينوم كفاءة. في تجربة نموذجية، والبلازميد كريسبر محددة الهدف وشظية الحمض النووي المستخدمة لتعديل الهدف هي ترانزفكتد المشارك في الطفيليات. إذا كان جزء من الحمض النووي المستخدمة لتعديل الهدف يحتوي على متواليات متجانسة إلى مكان الهدف، إعادة التركيب مثلي يمكن استخدامها لإصلاح دسب التي قدمها كريسبر / Cas9 للسماح بتعديل دقيق للهدف. من ناحية أخرى، إذا كانت إنتلا يحتوي جزء الحمض النووي المستنسخة على تسلسل مثلي، فإنه لا يزال من الممكن دمجها في موقع الاستهداف كريسبر / Cas9. وغالبا ما يستخدم هذا الأخير لتعطيل الجينات عن طريق إدراج علامات اختيار أو تكملة المسوخ في لوكسي التي تسمح الاختيار السلبي 13 . هنا هو المكان SNR1 بمثابة مثال لإظهار كيف كريسبر / Cas9 يمكن استخدامها لتعطيل الجينات وتوليد الطفيليات المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه البروتوكولات تقدم عدة طرق عندما مجتمعة تسمح لتحديد الجينات المقاومة للأدوية في T. غونديي . اثنان على وجه الخصوص كانت جزءا لا يتجزأ من المشروع، وطريقة محنك نسبيا من كتل رسم الخرائط وطريقة وضعت مؤخرا من كريسبر / Cas9 تحرير الجينات. نشرت لاندر وبوتستين ورقة مؤثرة في عام 1989 مما يدل على رسم الخرائط كتل التي تربط بين الوراثة الجينية مع الظواهر 36 . في الآونة الأخيرة في عام 2012، وصف دوندا وشاربنتيه نظام تحرير كريسبر / Cas9 في العقدية بيوجينيس 22 التي تم تكييفها بسرعة كأداة وراثية في العديد من النماذج المختلفة، بما في ذلك T. غونديي 13 ، 17 . كانت كلتا الطريقتين مفيدتين هنا، حيث حددت خريطة كتل الموضع الذي يحتوي على طفرة مقاومة المخدرات التي تم تحديدها في نهاية المطاف باستخدام وس استنادا كشف سنب، و كريسبر / Cas9 التحرير قدمت لي أنس لتأكيد SNR1 هو جينفونجين جين المقاومة المخدرات.
وقد تم تطوير ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب 8 أصلا لاستجواب النمط الظاهري الفوعة 19 ، ولكن سلالات الوالدين كما حدث أن يكون الفرق المظهري الإضافي الذي لم يعرف الجين السببية، ومقاومة سينفونجين في الأم فاند. هذا يسلط الضوء على فائدة واحدة من الصلبان في أنه يمكن إعادة استخدامها عند ملاحظة الاختلافات المظهري إضافية في الآباء والأمهات. كان هذا هو الحال بالنسبة لثلاثة توكسوبلازما أخرى، نوع 2 × نوع 3، حيث تم العثور على عدة جينات تشارك في الفوعة من خلال رسم خرائط المظاهر المتعددة 37 ، 38 ، 39 ، 40 . حتى الآن، تم وصف أربعة مفارق T. غونديي مختلفة وتستخدم لرسم خريطة الجينات المسؤولة عن المظاهرسس = "كريف"> 8 ، 37 ، 41 ، 42 ، وكلها لديها القدرة على إعادة استخدامها لرسم المظاهر الجديدة التي لا أساس لها أساس جيني. وعلى طول هذه الخطوط، تم تسلسل الجينومات ل 62 سلالة غونديي T. تمثل التنوع الجيني العالمي المعروف 43 . يمكن أن تكون الصلبان الجديدة من هذا التجمع لسلالات تختلف في الظواهر المثيرة للاهتمام. بعد أن طغت على مزايا رسم الخرائط كتل، فإنه يجب أن يقال أن توليد الصليب ليست مهمة طفيفة. هناك طرق أخرى يمكن استخدامها لتحديد الجينات السببية. تقنية واحدة قوية تستخدم الطفرات الكيميائية لخلق المسوخ التي يمكن فحصها عن المظاهر. للعثور على الجينات السببية، يمكن أن تكون إما المسوخ يمكن أن تستكمل مع المكتبات الكونية 44 أو طرق الجينوم ريسكنسينغ يمكن استخدامها للعثور على الطفرة السببية 45 . ل موعلى هذا، انظر اثنين من جوف المقالات التي كتبها كولمان وآخرون. ووالوين وآخرون. التي تحدد هذه النهج 46 و 47 .
تعتمد العديد من الخطوات المؤدية إلى التعرف على الطفرات السببية (شيف) (البروتوكولان 2 و 3) على الأساليب الحسابية التي يتم إجراؤها باستخدام البرمجيات المتوفرة مجانا للاستخدام الأكاديمي. يتم توفير أوامر مفصلة لكل خطوة وعندما تشغيل مع الملفات المناسبة سوف تسمح للمستخدم لإعادة إنشاء مجموعات البيانات اللازمة للعثور على السببية سنف ص سنب. نضع في اعتبارنا أن بعض بناء الجملة في الأوامر تشير إلى أسماء الملفات أو بنية الدليل ($ باث) التي يمكن تعديلها لتفضيل المستخدم. على الرغم من أن الأوامر الواردة هنا بالتأكيد لا تستنفد طرق يمكن للمرء أن تحليل الصليب مع تحليل كتل و وس استنادا سنب تحديد، فهي شاملة بما فيه الكفاية لتكرار التجربة المذكورة في هذه المقالة، وينبغي أن تسمح للمستخدم لتصبح م خام دراية كيف يتم استخدام هذه النهج بطريقة خطوة بخطوة.
على الرغم من أن كتل رسم الخرائط و وس على أساس تسلسل سنب على أساس كاف لتحديد الجين مرشح شنف r ، وهناك حاجة إلى تجارب إضافية لتأكيد دورها في مقاومة المخدرات. وهذا يمكن أن يكون مقنعا من خلال تعطيل الجينات أو تقنيات خروج المغلوب، وكلاهما يمكن أن يتحقق باستخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينات. يتم إعطاء أساليب مفصلة لاستخدام كريسبر / Cas9 إما توليد الطفرات إندل أو إدراج يبني المعدلة وراثيا في الجين الهدف في T. غونديي . خصوصية الاستهداف التي يوفرها كريسبر / Cas9 يزيد من كفاءة تحرير الجينات على الطرق التقليدية. أيضا، وهذا زيادة بكفاءة جعلت من الممكن استخدام سلالات غير المختبر تكييفها للدراسات الوراثية التي كان من الصعب سابقا تعديل 13 . على الرغم من أن في مرحلة الطفولة الأولى، كريسبر / Cas9 قد استخدمت بالفعل لجعل اضطرابات الجيناتلاس = "كريف"> 2 ، 13 ، 17 ، 18 ، 48 ، 49 ، الجينات الوسم 17 ، وجعل الجينات القاضية 16 ، 19 ، 50 ، 51 ، 52 ، 53 ، 54 في T. غونديي ، واعدة أن تكون أداة مفيدة للعديد من الدراسات الأخرى في المستقبل.
اكتشاف أن SNR1 تعطيل يؤدي إلى مقاومة سينفونجين يجعل SNR1 موقع موقع واعد لإدخال التحوير أو تكامل وراثي. لتحقيق أقصى قدر من النجاح في استخدام كريسبر / Cas9 بوساطة الجينات المستهدفة لتوجيه دمج التحوير في موضع SNR1 ، يجب أن تكون الجوانب التالية كونسيدالأحمر، إبان، ال التعريف، تجريبي، ديسين. أولا، ويوصى علامة اختيار ليتم تضمينها في بناء المعدلة وراثيا لزيادة كفاءة بناء سلالة. إذا تم تضمين علامة التحديد، يمكن استخدام كل من اختيار الإيجابية والسلبية، مما أدى إلى ما يقرب من 100٪ من الطفيليات المختارة مضاعفة كونها المعدلة وراثيا مع الحكومة الإسرائيلية متكاملة في موضع SNR1 . في المقابل، إذا كان البناء المعدلة وراثيا لا تحتوي على سمات اختيارية إضافية وتعتمد على الاختيار السلبي في موضع SNR1 ، وكفاءة ترانزجينيسيس ناجحة يعتمد إلى حد كبير على كفاءة نقل كبد من البلازميد كريسبر والبناء المعدلة وراثيا.
ثانيا، على الرغم من أن التكامل كريسبر / Cas9 بوساطة موقع معين من جزء الحمض النووي غير متماثلة وكثيرا ما تستخدم لتكملة و ترانزجينيسيس، تجدر الإشارة إلى أن التوجه الإدراج لا يمكن أن تكون مضمونة في مثل هذه الحالات كما إما الاتجاه ممكن. وهذا قد يشكل مشكلةمللي ثانية إلى بعض التطبيقات. على سبيل المثال، لتكملة متحولة مع الأليلات الجينات المختلفة، فمن الصعب التأكد من أن يتم إدراج جميع الأليلات في نفس التوجه، والتناقضات في التوجه قد يسبب الاختلافات التعبير. لهذا النوع من التطبيق، يبني الحمض النووي مع تسلسل مثلي لمكان SNR1 ينصح بها، والتي سوف تدفع التوجه التكامل الصحيح ( الشكل 6 ).
ثالثا، خلال ترنسفكأيشن، والنسبة بين البلازميد كريسبر وجزيء الحمض النووي المعدلة وراثيا أمر بالغ الأهمية لنجاح بناء سلالة المعدلة وراثيا. ويتعين تعديل هذه النسبة وفقا لاستراتيجيات الاختيار. ويوصى بالمبادئ التوجيهية التالية: 1) إذا كان بناء المعدلة وراثيا يحتوي على علامة مقاومة المخدرات والدواء المقابل هو الاختيار الوحيد المستخدم لتوليد الطفيليات المعدلة وراثيا، أي لا يستخدم سينفونجين، والنسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازما كريسبرمعرف هو 1: 5. استخدام المزيد من البلازميد كريسبر في هذه الحالة يزيد من احتمال أن الطفيليات تلقي بناء المعدلة وراثيا سوف تتلقى أيضا البلازميد كريسبر، وبالتالي الطفيليات المقاومة للمخدرات هي أكثر عرضة ليكون علامة إدراجها في موقع استهداف كريسبر. إذا تم عكس نسبة، فإن معظم الطفيليات التي تتلقى بناء المعدلة وراثيا لن تحصل على البلازميد كريسبر. ونتيجة لذلك، فإن الغالبية العظمى من الطفيليات المقاومة للمخدرات الحصول على بناء المعدلة وراثيا من خلال التكامل العشوائي لا يرتبط مع كريسبر / CAS9 بوساطة موقع محدد الإدراج. 2) إذا كان بناء المعدلة وراثيا يحتوي على علامة مقاومة المخدرات ويستخدم الدواء المقابلة جنبا إلى جنب مع سينفونجين لتحديد الطفيليات المعدلة وراثيا، والنسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازميد كريسبر هو 1: 1. توفر هذه الاستراتيجية أعلى كفاءة البناء سلالة المعدلة وراثيا. 3) إذا كان التركيب المعدلة وراثيا لا يحتوي على صانع للاختيار، والاعتماد على اختيار السلبيةبواسطة سينفونجين وحدها للحصول على الطفيليات المعدلة وراثيا، ونسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازميد كريسبر هو 5: 1. والأساس المنطقي لهذا التصميم هو نفسه كما في المبدأ التوجيهي الأول أعلاه. منذ استخدام كل من بيريميثامين و سينفونجين للاختيار في البروتوكول 5، تم تعيين النسبة بين دفر * الجينات البسيطة و SNR1 استهداف البلازميد كريسبر كما 1: 1.
وإذا أخذنا معا، فإن الأساليب المبينة هنا لها مستوى من التفصيل لم يكن ممكنا نقله في المنشور الأصلي الذي حدد SNR1 2 . هذه البروتوكولات. على وجه التحديد، وبناء جملة سطر الأوامر، والتخطيط التسلسلي للبرامج المستخدمة، واستخدام كريسبر / Cas9 يجب أن تساعد المساعي المستقبلية لتحديد الجينات الجديدة المسؤولة عن المظاهر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر L. ديفيد سيبلي وآسيس خان لمساهمتهم في المنشور الأصلي الذي تستند إليه هذه البروتوكولات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة AI108721.
Materials
| T25 flasks | Corning | 430639 | |
| HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
| T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
| T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
| DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
| Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
| Syringe 10ml | BD | 309604 | |
| Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
| Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
| Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
| Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
| R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
| Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
| NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
| SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
| VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
| MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
| pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
| pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
| pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
| L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
| Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
| Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
| 6-well TC plate | Corning | 353046 | |
| 24-well TC plate | Corning | 353935 | |
| Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
| 96-well TC plate | Corning | 353075 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |
References
- Dubey, J. P. The history of Toxoplasma gondii–the first 100 years. J Eukaryot Microbiol. 55 (6), 467-475 (2008).
- Behnke, M. S., Khan, A., Sibley, L. D. Genetic Mapping Reveals that Sinefungin Resistance in Toxoplasma gondii Is Controlled by a Putative Amino Acid Transporter Locus That Can Be Used as a Negative Selectable Marker. Eukaryot Cell. 14 (2), 140-148 (2015).
- Dubey, J. P. History of the discovery of the life cycle of Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. 39 (8), 877-882 (2009).
- Pfefferkorn, L. C., Pfefferkorn, E. R. Toxoplasma gondii: genetic recombination between drug resistant mutants. Exp Parasitol. 50 (3), 305-316 (1980).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Insertional mutagenesis and marker rescue in a protozoan parasite: cloning of the uracil phosphoribosyltransferase locus from Toxoplasma gondii. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5749-5753 (1995).
- Sullivan, W. J. Insertional tagging of at least two loci associated with resistance to adenine arabinoside in Toxoplasma gondii, and cloning of the adenosine kinase locus. Mol Biochem Parasitol. 103 (1), 1-14 (1999).
- Khan, A. Composite genome map and recombination parameters derived from three archetypal lineages of Toxoplasma gondii. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2980-2992 (2005).
- Khan, A. NextGen sequencing reveals short double crossovers contribute disproportionately to genetic diversity in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15 (1), 1168 (2014).
- Shaik, J. S., Khan, A., Beverley, S. M., Sibley, L. REDHORSE-REcombination and Double crossover detection in Haploid Organisms using next-geneRation SEquencing data. BMC Genomics. 16 (1), 133 (2015).
- Arends, D., Prins, P., Jansen, R. C., Broman, K. W. R/qtl: high-throughput multiple QTL mapping. Bioinformatics. 26 (23), 2990-2992 (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Koboldt, D. C. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9. MBio. 5 (3), e01114 (2014).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryot Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryot Cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Wang, J. L. The Past, Present, and Future of Genetic Manipulation in Toxoplasma gondii. Trends Parasitol. , (2016).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient genome engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. PLoS One. 9 (6), e100450 (2014).
- Sugi, T., Kato, K., Weiss, L. M. An improved method for introducing site-directed point mutation into the Toxoplasma gondii genome using CRISPR/Cas9. Parasitol Int. , (2016).
- Behnke, M. S. Rhoptry Proteins ROP5 and ROP18 Are Major Murine Virulence Factors in Genetically Divergent South American Strains of Toxoplasma gondii. PLoS Genet. 11 (8), e1005434 (2015).
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S., Doudna, J. A. STRUCTURAL BIOLOGY. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science. 348 (6242), 1477-1481 (2015).
- Nishimasu, H. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
- . Available from: https://www.r-project.org (2016)
- Smith, R., Sheppard, K., DiPetrillo, K., Churchill, G. Quantitative trait locus analysis using J/qtl. Methods Mol Biol. 573, 175-188 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kurtz, S. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome Biol. 5 (2), (2004).
- Gajria, B. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36 (Database issue), D553-D556 (2008).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
- Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol. 219, 247-259 (1996).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Lander, E. S., Botstein, D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics. 121 (1), 185-199 (1989).
- Saeij, J. P. Polymorphic secreted kinases are key virulence factors in toxoplasmosis. Science. 314 (5806), 1780-1783 (2006).
- Saeij, J. P. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
- Rosowski, E. E. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
- Reese, M. L., Zeiner, G. M., Saeij, J. P., Boothroyd, J. C., Boyle, J. P. Polymorphic family of injected pseudokinases is paramount in Toxoplasma virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9625-9630 (2011).
- Taylor, S. A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogen Toxoplasma gondii. Science. 314 (5806), 1776-1780 (2006).
- Behnke, M. S. Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9631-9636 (2011).
- Lorenzi, H. Local admixture of amplified and diversified secreted pathogenesis determinants shapes mosaic Toxoplasma gondii genomes. Nat Commun. 7, 10147 (2016).
- Gubbels, M. J. Forward genetic analysis of the apicomplexan cell division cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36 (2008).
- Farrell, A. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
- Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), (2012).
- Walwyn, O. Forward genetics screens using macrophages to identify Toxoplasma gondii genes important for resistance to IFN-gamma-dependent cell autonomous immunity. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rugarabamu, G., Marq, J. B., Guerin, A., Lebrun, M., Soldati-Favre, D. Distinct contribution of Toxoplasma gondii rhomboid proteases 4 and 5 to micronemal protein protease 1 activity during invasion. Mol Microbiol. 97 (2), 244-262 (2015).
- Varberg, J. M., Padgett, L. R., Arrizabalaga, G., Sullivan, W. J. TgATAT-Mediated alpha-Tubulin Acetylation Is Required for Division of the Protozoan Parasite Toxoplasma gondii. mSphere. 1 (1), (2016).
- Zheng, J., Jia, H., Zheng, Y. Knockout of leucine aminopeptidase in Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. Int J Parasitol. 45 (2-3), 141-148 (2015).
- Long, S., Wang, Q., Sibley, L. D. Analysis of Noncanonical Calcium-Dependent Protein Kinases in Toxoplasma gondii by Targeted Gene Deletion Using CRISPR/Cas9. Infect Immun. 84 (5), 1262-1273 (2016).
- Wang, K. Identification of Novel O-Linked Glycosylated Toxoplasma Proteins by Vicia villosa Lectin Chromatography. PLoS One. 11 (3), e0150561 (2016).
- Yang, M., Zheng, J., Jia, H., Song, M. Functional characterization of X-prolyl aminopeptidase from Toxoplasma gondii. Parasitology. , 1-7 (2016).
- Zhang, W. Analysis of the virulence determination mechanisms in a local Toxoplasma strain (T.gHB1) isolated from central China. Parasitol Res. , (2016).
