Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Bitki büyüme ve gelişme çalışması uzun zaman önce ölmüş, sabit dokuları kullanılarak ve uygun hücresel çözünürlük eksik deneysel teknikler güvenmiştir. sayısız floroforların gelişimi ile kombine eş odaklı mikroskopi son gelişmeler, bu sorunları aşmak ve canlı örneklerde, iyi bir hücresel çözünürlükte, aynı anda birkaç genlerin ifadesini çalışma imkanı açtı. Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç ile bitki biyologlar sağlar ve yoğun kök büyümesi ve sürgün apikal meristem yamaçlarında yanal organlarının oluşumunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, yaygın nedeni böyle çiçek meristem üzerinde büyümeye sepals olarak çiçekler, görüntülenmesi ve bu altta kalan dokulardan floresan filtre özgü zorluklara kısmen, çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. Burada, Arap gelişmekte canlı canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol mevcutDik veya ters bir mikroskop kullanılarak idopsis çiçek tomurcukları.
ya meristeme – – Filiz ve köklerin bitki gövdesinin çoğu kök ucundaki veya yakınında hücrelerin gruplardan post-embriyonik oluşturur. Vejetatif aşamasında bırakır ve çiçek meristemler (FMS) üreme faza geçiş yapar sonra: yetişkin bitkinin toprak üzerinde kalan tüm yapıların sürekli olarak yanları lateral organ üreten sürgün apikal meristem (SAM) türer. sırayla Dışişleri bakanları çiçeklerin içine gelişir. Arabidopsis SAM zamanda yan organların bir üretirken, yinelemeli bir, yay örgüsü içinde FMS birden fazla gelişim programları aynı anda çözülüyor ile, kısmen eş zamanlı bir şekilde, dört kıvrımları olan çiçek organları dört tip üretir. Farklı çiçek organlarının kimlik şartname altında yatan genetik ağların kısmen çiçek developme ki, ama pek çok açıdan (yorumlara, referanslar 1, 2 bakınız) deşifre edilmişnt, örneğin bitkisel, organ konumlandırma ve kıvrımları arasındaki sınırların tanımı olarak, yeterince anlaşılamamıştır.
Bitki gelişiminin erken moleküler genetik çalışmalar daha çok gen ekspresyonunu analiz etmek için in situ hibridizasyon ve GUS muhabir gibi teknikler dayanıyordu. Bu yöntemler bilgi hazinesi sağlanan ve büyük ölçüde bitki büyüme ve çiçek gelişimi anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, önemli sınırlamalar vardır: onlar iyi hücresel çözünürlük eksikliği, aynı birden fazla genlerin ifade örneğinin kolay gözlem için izin vermez numuneler, ve daha da önemlisi, sadece ölü sabit dokular için uygulanabilir. Konfokal mikroskopi son gelişmeler bu sınırlamaları aşmak ve işlemesi ile altta yatan bitki morfogenetiğine araştırmak için güçlü bir araç ile gelişimsel biyologlar sağlamak var. Özellikle, konfokal mikroskopi c bunların oluşum boyunca canlı doku ve organların gözlem sağlarTamamen böyle bir gelişme olarak bir özünde dinamik süreci anlamak için ritical.
Canlı konfokal görüntüleme yoğun, (mesela referanslar 7, 8 (örneğin 3 başvuran 4, 5, 6), ancak birkaç raporların haricinde SAM tarafından bitkilerin havadan büyüme ve yanal organlarının üretimini analiz etmek için kullanılmıştır 9, 10), bu yaygın çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. SAM canlı eş odaklı görüntüleme için protokoller (örneğin 12 11 başvuran) kullanılabilir ve SAM çevreleyen nasıl görüntüye gelişmekte çiçek tomurcukları için iyi bir temel sağlar. Ancak, görüntüleme çiçek tomurcukları belirli zorluklar ortaya: Örneğin,Çiçek tomurcukları hızlı SAM daha büyük hale gelir ve aşama 4'te, çanak yaprakları (referans 13'de tarif edildiği gibi aşamaları), FM kapsayan ve bu dokular (Şekil 2A) altta yatan floresans karartma başlar. Burada, dik ya da ters bir mikroskop ve bir su-daldırma lens kullanarak Arabidopsis çiçek tomurcukları geliştirmeye canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl açıklayan ayrıntılı bir protokol sağlar. Daha önce referans 14'de bu protokolü yayınladı.
Burada, bir konfokal mikroskop ve bir su-daldırma lens ile canlı, gelişmekte Arabidopsis çiçek tomurcukları görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu dik veya ters bir mikroskop ya ile yapılabilir iken, daha kolay ve eski kullanımı hızlıdır. Farklı konfokal sistemleri dalga boylarını ayırmak için hız, hassasiyet ve yetenek açısından anlamlı farklılıklar gösterdiğini belirtmek gerekir. Aynı örneklerde, en iyi konfokal mikroskop artık görüntü birkaç farklı kanallar (Şekil 2G örneğin, GFP, YFP, DsRed ve propidyum iyodür) izin verir. Bazı konfokal mikroskop aynı anda birkaç fluorophores floresans toplamak ve daha sonra bunları ayırmak için bir spektral dedektörü ile donatılmıştır. normal bir detektör kullanılarak, ancak, lazerler ve bir filtre grubu heyecan ve farklı flüorofor floresans ayırmak için kullanılmalıdır. Bazı floroforlar tamamen farklı emisyon spektrumları (örn CFP bird YFP), ve aynı zamanda görüntülenebilir. Başka fluoroforlar, kısmen üst üste emisyon spektrumunu (örneğin, GFP ve YFP) olabilir ve genellikle görüntüleme süresini arttırır, ayrıca görüntülü gerekir. yakın florofor Görüntüleme aynı zamanda sık sık bir kanal içine sızmasını bir florofor floresans önlemek için, her bir kanal için toplanır ne spektrumunun çok kısıtlayıcı gerektirir. Bu lazer güç ve kazanç bir artışla telafi edilebilir toplanan sinyalin, yoğunluğu kaybına neden olur. Bununla birlikte, uzun süreli görüntüleme zamanı ve daha yüksek lazer gücü ağartıcı ve / veya örnek zarar verebilir. Artan lazer güç ve / veya kazanç da arka plan gürültüsünü artabilir. Sinyal yoğunluğu, çözünürlük ve her bir numune için görüntüleme sürelerini kısaltıyor deneme-yanılma sürecinden yapılır ve kalıcı dengeler müdahalesi içermez.
Bu protokol bir disseke sürgün ucuna yamaçlarında gelişen çiçek tomurcukları canlı konfokal görüntüleme gerçekleştirmek açıklar. OSürgün ucu bitkinin geri kalanına bağlı olan ve olmayan olması SAM ve çiçek gelişimini etkileyebilecek cytokinins içeren bir ortamda yetişen iddia edilebilir. Ancak, bu orta apikal meristemler, normal plastochron yeni çiçek tomurcukları üretmek ve bu çiçek tomurcukları normalde 15 geliştirdiğini disseke ateş sağlamak için bir deneme-yanılma süreci ile ampirik olarak tasarlanmıştır. Benzer şekilde, çanak yaprağı diseksiyon gen ekspresyonu veya çiçeğin kalanı gelişimini etkilediği görünmüyor. SAM canlı confocal görüntüleme gerçekleştirme başka protokoller detaylı halen (örneğin 11 referans) bitkinin geri kalanına bağlanmış. Bu protokoller üzere uyarlanmış ve özellikle oksinle ilgili süreçler üzerinde çalışılması sırasında, çiçek geliştirme görüntüleme için yararlı bir alternatif sunmaktadır edilebilir. kök uzayarak katlanmış, ve çiçek tomurcuklarının yönünü değiştirir;: Bunlar çeşitli dezavantajları mevcut birbitkinin geri kalanına bağlı bir tepe sürgünü görüntüleme dik bir mikroskop ile iyi çalışır iken nd, bir ters mikroskop ile bunu çok daha karmaşıktır.
Daldırma lensler "kuru" lens sistemi (hava ile numuneden ayrılır yani lensler) daha iyi bir sayısal açıklık (NA) sahiptir ve bu yüzden bir konfokal mikroskop kullanılarak zaman kritik numune, daha ince bir çözünürlüğü sağlar. Görüntüleme işlemi sırasında dehidrasyon gelen tepe sürgünü önlerken su daldırma lens kullanarak böylece kuru lens çok daha iyi NA sağlar. gliserin ve yağ lensler su lensler daha da yüksek NA sahip olsa da, bir numunede de zaman atlamalı deneyler sırasında büyüyen tutan bir sürgün ucuna, büyüklüğü ile çok kullanışsız olduğu bir lamel, kullanımını gerektirebilir. Numunelerin boyutu göz önüne alındığında, uzun bir çalışma mesafesi olan bir lens kullanmak da önemlidir (çiçek kademelerine bağlı olarak, yığın boyunca 150 um kalınlığında olabilir). Bu tipik olarak 1 bir NA ve 1.7-2.5 mm arasında bir çalışma mesafesi ile bir 20 ya da 40 kat lens kullanımı.
Konfokal mikroskop yazılım üç boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2, B1, B2 ve B4) ve dilim görüntüleme (Şekil 2, B3) de dahil olmak üzere konfokal verileri görselleştirmek için çeşitli yöntemler sunar. En yaygın olarak kullanılan üç boyutlu görüntüleme konfokal Z yığınlar (Şekil 2, B1 ve B4) bazı yazılım maksimum yoğunluğu çıkıntıları iken (örneğin, Zen ve Imaris), aynı zamanda, derin kısımlarında sinyali süzer şeffaflığı manzarası sunar epidermal tabaka olarak ifade yer alan süreçlerin veya gen bakarken yararlı olabilir numunesi (Şekil 2, B2). Sinyal yoğunluğu, ya piksel inte kullanılarak, tek bir renk (Şekil 2, B1) ile kodlanabilirnsity ya da bir renk kodu (Şekil 2, B4) kullanılarak.
Canlı konfokal görüntüleme sadece çiçek gelişimi için değerli kalitatif irdeliyoruz, aynı zamanda potansiyel olarak nicel veri zenginliği ile gelişimsel biyologlar sağlar. Farklı yazılım (örneğin Imaris, Fiji, Mars-ALT, MorphographX 15, 20, 21) sayısına ya da bir ya da daha muhabir ya da farklı hücrelerde bir raportör ekspresyon seviyesini gösteren hücrelerin hacim ölçümü için izin verir. Bu tür yazılımlar da, otomatik hücre segmentasyon gerçekleştirme hücre soylarından izlemek ve büyümeyi ölçmek için kullanılabilir. Bu, farklı yazılım benzer araçlar sunar, aynı zamanda birçok yönden farklıdır. Mars-ALT MorphoGraphX Imaris a farklı olarak, bitki 15, 20, 21 için özel olarak tasarlanmıştırnd Fiji. Imaris ve Mars-ALT bütün örneğin bölümlere ve analiz için izin verirken MorphoGraphX sadece epidermal tabakasının parçalara ve analiz edilmesine izin vermektedir. Bununla birlikte, Mars ALT üç farklı açılardan 15 aynı örnek önceden görüntüleme gerektirir ve Imaris yalnızca tek bir yığın gerektirir. nicel bilgiye erişim çiçek gelişiminin anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Yazar, desteğinden ötürü Prof. Elliot M. Meyerowitz teşekkür etmek istiyorum ve teknik sorunları çözmede yardım için Caltech'te Biyolojik Görüntüleme Tesisinde Dartmouth Koleji ve Dr Andres Collazo de el yazması üzerinde yorum, hem de Ann Lavanway canlı eş odaklı görüntüleme. Nathanaël Prunet çalışmaları Elliot M. Meyerowitz Grant R01 GM104244 aracılığıyla Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |