라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 생물 학자를 제공합니다. 여기, 우리 애기 꽃을 개발하는 라이브 공 촛점 이미징에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
식물의 성장과 발전의 연구는 긴 죽은, 고정 된 조직을 사용하고 적절한 세포 해상도가 부족한 실험 기술에 의존하고있다. 많은 형광 물질의 개발과 함께 공 초점 현미경의 최근 발전은 이러한 문제를 극복 라이브 샘플에서 좋은 세포 해상도, 동시에 여러 유전자의 발현을 연구 할 수있는 가능성을 열었다. 라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 식물 생물학을 제공하고, 광범위하게 뿌리 성장과 촬영 정단 분열 조직의 측면에 측면 기관의 형성을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 널리 때문에 같은 꽃 분열 조직을 통해 성장 꽃받침 같은 꽃, 이미징 및 기본 조직에서 형광을 필터링 할 특정 문제에 부분적으로 꽃 개발의 연구에 적용되지 않았습니다. 여기, 우리는 아랍을 개발, 라이브 라이브 공 촛점 이미징을 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 제시수직 또는 거꾸로 현미경을 사용하여 idopsis 꽃 봉오리.
또는 정단 분열 조직 – – 싹과 뿌리의 식물체의 대부분은 줄기 끝이나 근처에 위치한 세포의 그룹에서 포스트 embryonically 형성한다. 생장 단계에서 잎과 꽃 분열 조직 FMS ()는 생식 단계로 전환 후 : 어른 공장의 모든 지상 구조는 지속적으로 측면에 측면 장기를 생산하는 촬영 정단 분열 조직 (SAM)에서 파생. 차례로 FM에 꽃으로 개발한다. 아라비돕시스 SAM 한번에 측 장기 하나를 생성하는 동안, 반복, 나선형 패턴, FM에 여러 개발 프로그램을 동시에 탈피하여, 부분적으로 동시 방식으로 나선 부 내의 네 꽃 기관의 네 가지 유형을 생성한다. 다른 꽃 기관의 정체성의 사양을 기본 유전자 네트워크는 부분적으로 꽃 developme에의,하지만 여러 측면 (리뷰를 위해, 참고 문헌 1, 2 참조) 해독 된NT, 같은 꽃 장기 위치와 나선 부 사이의 경계의 정의로, 제대로 이해 남아 있습니다.
식물 개발의 초기 분자 유전 학적 연구는 주로 같은 유전자 발현을 분석하는 현장 하이브리드 및 GUS 기자의 같은 기술에 의존했다. 이러한 방법은 풍부한 정보를 제공하고 크게 식물의 성장과 꽃 개발에 대한 우리의 이해에 기여하고 있지만, 중요한 제한 사항이 있습니다 : 그들은 좋은 셀룰러 해상도 부족, 같은 여러 유전자의 발현 패턴의 관찰이 쉬운을 허용하지 않습니다 샘플, 그리고 중요한 것은, 오직 죽은, 고정 된 조직에 적용 할 수 있습니다. 공 초점 현미경의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고, 프로세스를 기본 식물의 형태 형성을 조사 할 수있는 강력한 도구로 발달 생물 학자를 제공했다. 특히, 공 초점 현미경은 C가 자신의 형성에 걸쳐 라이브 조직과 장기의 관찰이 가능완전히 같은 개발 등의 정수를 보여주는 역동적 인 과정을 이해하기 ritical.
라이브 촛점 촬상 광범위하게 (예를 들어 참고 문헌 7, 8의 (예를 들어, 3 참조 4, 5, 6), 그러나 약간의 보고서를 제외하고 SAM에 의해 식물의 공중 성장 횡 기관의 생산을 분석하는 데 사용 된 9, 10), 널리 꽃 개발의 연구에 적용되지 않았습니다. 샘의 라이브 공 촛점 이미징을위한 프로토콜 (예, 12 11 참조) 사용할 수 있으며, SAM을 둘러싸는 방법을 이미지로 개발 꽃 봉오리를위한 좋은 기반을 제공합니다. 그러나, 영상 꽃 봉오리가 특정 과제 제시 : 예를 들어,꽃 봉오리 신속 SAM보다 크게되고, 스테이지 (4)에서, 꽃받침은 (기준 13에 기재된 바와 같이 단계)이 FM을 피복하고, 조직을 (도 2A)를 하부에서 형광 디밍 시작. 여기, 우리는 똑바로 또는 거꾸로 현미경과 물에 침지 렌즈를 사용 애기 꽃 봉오리 개발에 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이전에 참조 (14)이 프로토콜을 발표했다.
여기, 우리는 공 초점 현미경과 물에 침지 렌즈와 라이브 개발, 애기 꽃 봉오리의 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다. 이 직립하거나 거꾸로 현미경 중 하나와 함께 할 수 있지만, 쉽고 전자를 사용하는 것이 더 빠릅니다. 이것은 다른 공 초점 시스템은 파장을 분리하는 속도, 감도 및 기능면에서 크게 차이가 있음을 주목할 가치가있다. 동일한 샘플에 상기 최상의 촛점 현미경 이미지는 이제 여러 채널 (도 2G 예 : GFP, YFP DsRed의 및 프로피 듐 요오다 이드) 할 수있다. 일부 공 초점 현미경은 동시에 여러 형광 물질에서 형광을 수집하고 나중에 그들을 분리 할 수있는 스펙트럼 검출기가 장착되어 있습니다. 일반 검출기를 사용하는 경우, 그러나, 레이저 및 필터 집합은 여기 및 다른 형광체로부터의 형광을 분리하는 데 사용되어야한다. 일부 형광 완전히 별개의 발광 스펙트럼을 (예를 들어, CFP의YFP D)과 동시에 이미지화 될 수있다. 다른 형광체는 부분적으로 중첩하는 발광 스펙트럼 (예 : GFP 및 YFP)가, 통상 촬영 시간을 증가시킨다 별도로 이미징 될 필요가있다. 가까운 형광 이미징하는 것은 종종 다른 채널로의 누출 한 형광 물질로부터의 형광을 방지하기 위해 각각의 채널에 대해 수집하는 방식, 스펙트럼의 많은 제한이 필요하다. 이 레이저 전력 및 이득의 증가에 의해 보상 될 수 수집 된 신호의 세기의 손실을 야기한다. 그러나, 장시간 촬상 시간 증가 레이저 파워 표백제 및 / 또는 샘플이 손상 될 수있다. 증가 레이저 파워 및 / 또는 이득은 배경 잡음이 증가 할 수 있습니다. 신호 강도, 해상도 및 각 샘플에 대한 촬상 시간의 최적화는 시행 착오 프로세스를 수행하고, 영구 절충을 수반한다.
이 프로토콜은 해부 촬영 정점의 측면에서 개발 꽃 봉오리의 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 그것촬영의 정점은 식물의 나머지 부분에 연결되어 있지 않다는 사실은 SAM과 꽃 개발에 영향을 미칠 수있는 토키 닌을 포함하는 배지에서 성장한다고 주장 할 수있다. 그러나이 매체는 혀끝의 분열 조직이 정상 plastochron에서 새로운 꽃 봉오리를 생산,이 꽃 봉오리는 일반적으로 15 개발하는 해부 촬영을 보장하기 위해 시행 착오 과정을 통해 경험적으로 설계되었다. 마찬가지로, 꽃받침 잎 해부는 유전자 발현 패턴이나 꽃의 나머지 부분의 발전에 영향을 나타나지 않습니다. 샘의 라이브 공 촛점 이미징을 수행하는 방법을 다른 프로토콜 세부 사항은 여전히 (예 11 참조) 식물의 나머지 부분에 연결합니다. 이러한 프로토콜에 적응, 특히 닌 관련 프로세스를 연구 할 때, 꽃을 개발하는 이미징을위한 유용한 대안을 제공 할 수있다. 줄기가 신장과 왜곡을하고, 꽃 봉오리의 방향을 변경; 그들은 그러나 몇 가지 단점을 제시 에이식물의 나머지 부분에 부착 된 촬영 정점을 이미징하는 것은 직립 현미경으로 잘 작동하는 동안 차, 그것은 거꾸로 현미경으로 그렇게 훨씬 더 복잡하다.
침지 렌즈 "건조"렌즈 (공기 샘플로부터 분리되는, 즉 렌즈)보다 더 개구 수 (NA)를 가지며, 그러므로 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 경우 중요하다 시료의 미세한 해상도를 제공한다. 촬상 탈수 과정에서 촬영 에이펙스를 방지하면서, 물 침지 렌즈를 사용하기 때문에, 건조 렌즈보다 훨씬 더 NA를 제공한다. 글리세린과 오일 렌즈는 물 렌즈보다 더 높은 NA를 가지고 있지만, 그들은 샘플 또한 시간 경과 실험을하는 동안 성장 유지하는 촬영 정점의 크기에 매우 비실용적 인 커버 슬립의 사용을 필요로한다. 샘플의 크기를 감안할 때, 긴 작동 거리를 가진 렌즈를 사용하는 것도 중요하다 (꽃 단계에 따라, 스택을 통해 150 μm의 두께가 될 수 있습니다). 우리는 일반적으로 (1)의 NA 및 1.7-2.5 mm의 작업 거리 : 20 또는 40X 렌즈를 사용한다.
공 초점 레이저 주사 현미경 소프트웨어 삼차원 재구성 (도 2, B1, B2 및 B4)와 슬라이스 뷰 (도 2, B3)을 포함 촛점 데이터를 시각화하는 여러 가지 방법을 제공한다. 가장 일반적으로 사용되는 입체보기는 촛점 Z-스택 (도 2, B1 및 B4), 일부 소프트웨어의 최대 강도의 돌출부가 있지만 (예 ZEN 및 Imaris)도의 깊은 부분에서 상기 신호를 필터링하여 해당 투명도 전망을 제공 표피층으로 표현 일어나는 프로세스 또는 유전자에서 볼 때 유용 할 수있는 샘플 (도 2, B2). 신호 강도가 어느 화소 INTE를 이용하여 단일 컬러 (도 2, B1)로 코딩 될 수있다nsity 또는 컬러 코드 (도 2, B4)를 사용.
라이브 공 촛점 영상뿐만 아니라 꽃 개발에 중요한 질적 통찰력을 제공하고, 또한 잠재적으로 정량적 데이터의 풍부한 발달 생물학을 제공합니다. 다양한 소프트웨어 (예 Imaris는 피지, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21)의 수 또는 하나 이상의 리포터 또는 다른 세포에서 리포터의 발현 수준을 발현하는 세포의 양의 정량화를 허용한다. 이러한 소프트웨어는, 자동 세포 분할을 수행하는 세포 계통을 추적하고 성장을 정량화하는데 사용될 수있다. 이 다른 소프트웨어는 비슷한 도구를 제공뿐만 아니라 여러 가지면에서 다르다. MARS-ALT 및 MorphoGraphX는 Imaris a를 달리 식물 15, 20, 21을 위해 특별히 설계되었습니다ND 피지. Imaris 화성-ALT 전체 샘플의 분류 및 분석을 허용하면서 MorphoGraphX은, 표피층의 분류 및 분석을 허용한다. 그러나, 화성 ALT 세 가지 각도 (15)로부터 동일한 샘플의 이전 영상을 필요로하고, Imaris는 단일 스택을 요구한다. 양적 정보에 대한 액세스는 꽃 개발에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 그의 지원을위한 교수 엘리엇 M 메이어오위츠 감사드립니다, 그리고 기술적 인 문제를 해결하는 그들의 도움을 캘리포니아 공과 대학에서 생물 이미징 시설에서 다트머스 대학 박사 안드레스 콜라조의 원고에 대한 의견뿐만 아니라, 앤 라반웨이 라이브 공 촛점 영상. 나다나엘 프루넷의 작품은 엘리엇 M 메이어오위츠에 부여 R01 GM104244를 통해 미국 국립 보건 연구소에 의해 지원됩니다.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |