Live-konfokale Abbildung stellt Biologen ein leistungsfähiges Werkzeug zum Studium der Entwicklung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Live – konfokale Abbildung von Arabidopsis Blumen zu entwickeln.
Die Studie von Pflanzenwachstum und Entwicklung ist seit langem auf experimentelle Techniken verlassen mit Toten, fixierten Gewebe und korrekte zelluläre Auflösung fehlt. Jüngste Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie, mit der Entwicklung zahlreicher Fluorophore kombiniert, haben diese Probleme überwinden und eröffneten die Möglichkeit, die Expression verschiedenen Gene gleichzeitig zu studieren, mit einer guten zellulärer Auflösung, in Live-Proben. Live-konfokale Bildgebung liefert Pflanzenbiologen mit einem leistungsfähigen Tool-Entwicklung zu studieren, und wurde ausgiebig verwendet, um das Wurzelwachstum und die Bildung von seitlichen Organen an der Flanke des Sprossapikalmeristem zu studieren. Es wurde jedoch nicht in breitem Umfang auf das Studium der Blütenentwicklung angewandt, aufgrund Herausforderungen teil, die spezifisch Blumen Bildgebung, wie die Kelchblätter, die über die Blume meristem wachsen, und die Fluoreszenz von darunter liegenden Gewebe herauszufiltern. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll Live-konfokale Abbildung auf live aufzutreten, die Entwicklung von Arabidopsis Blütenknospen, entweder eine aufrechte oder eine umgekehrte Mikroskop.
Die meisten der Pflanzenkörper bildet post-embryonal aus Gruppen von Stammzellen bei oder in der Nähe der Spitze befindet – oder apikalen Meristemen – der Triebe und Wurzeln. All oberirdischen Strukturen der erwachsenen Pflanze stammen aus dem Sprossapikalmeristem (SAM), die kontinuierlich seitliche Organe an seiner Flanke erzeugt: Blätter während der Vegetationsphase und Blumen Meristeme (FM), nachdem es in der reproduktiven Phase übergeht. FMs wiederum entwickeln sich zu Blumen. Während die Arabidopsis SAM eine seitliche Organe zu einer Zeit erzeugt, in einem iterativen, Spiralmuster erzeugen FMs vier Arten von Blütenorganen innerhalb von vier Quirle, in einer teilweise synchron mit mehreren gleichzeitig entwirren Entwicklungsprogramme. Teilweise entziffert (auf Bewertungen, 1 Referenzen sehen, 2), aber viele Aspekte der Blume developme Die genetischen Netzwerke , die Spezifikation der Identität der einzelnen Blütenorgane zugrunde liegen wurdennt, wie Blütenorgan Positionierung und die Festlegung der Grenzen zwischen Wirtel bleiben schlecht verstanden.
Frühe molekulargenetische Studien der Pflanzenentwicklung meist auf Techniken verlassen, wie in situ Hybridisierung und GUS – Reporter – Gen – Expression zu analysieren. Während diese Verfahren eine Fülle von Informationen und stark dazu beigetragen, unser Verständnis von Pflanzenwachstum und Blütenentwicklung zur Verfügung gestellt haben, gibt es wichtige Einschränkungen: sie gute zelluläre Auflösung fehlen, nicht erlauben, für die einfache Beobachtung des Expressionsmusters von mehreren Genen in den gleichen Proben, und wichtiger ist, kann nur tot, fixierten Gewebe aufgebracht werden. Jüngste Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie haben diese Einschränkungen zu überwinden, und Entwicklungsbiologen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Verfügung stellen Prozesse in der Pflanze Morphogenese zu untersuchen. Insbesondere ermöglicht die konfokale Mikroskopie für die Beobachtung von lebenden Geweben und Organen während ihrer Bildung, die critische voll einen durch und durch dynamischen Prozess wie Entwicklung zu verstehen.
Live konfokale Bildgebung wurde umfassend das Antennenpflanzenwachstum und die Produktion von lateralen Organen durch die SAM zu analysieren (zB Referenzen 3, 4, 5, 6), jedoch mit der Ausnahme einiger weniger Berichte (zB Referenzen 7, 8, 9, 10), hat es nicht auf das Studium der Blütenentwicklung weit verbreitet. Protokolle für die Live – konfokale Bildgebung des SAM zur Verfügung (zB 11 Referenzen, 12) liefern und die Entwicklung von Blütenknospen eine gute Basis für wie das Bild, die die SAM umgeben. Allerdings Bildgebung Blütenknospen besondere Herausforderungen stellen: zum Beispiel,Blütenknospen werden schnell größer als das SAM, und bei der Stufe 4, beginnen die Kelchblätter FM (Stufen wie in Bezug 13 beschrieben) abdeckt, und Dimmen die Fluoreszenz von Geweben (2A) zugrunde liegen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zu erklären, wie entweder live konfokale Bildgebung durchzuführen auf der Entwicklung von Arabidopsis Blütenknospen mit einem aufrechten oder einem umgekehrten Mikroskop und ein wasserTauchLinse. Wir veröffentlichten vorher dieses Protokoll in Bezug 14.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Abbildung von lebenden, sich entwickelnden Arabidopsis Blütenknospen mit einem konfokalen Mikroskop und einem Wassertauchlinse. Während dies kann entweder mit einem aufrechten oder einem inversen Mikroskop durchgeführt wird, ist es einfacher und schneller die ersteren zu verwenden. Es ist auch erwähnenswert, dass verschiedene konfokale Systeme unterscheiden sich erheblich in Bezug auf Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und die Fähigkeit, Wellenlängen zu trennen. Die besten konfokalen Mikroskopen ermöglichen nun mehrere verschiedene Bildkanäle (zB GFP, YFP, dsRed und Propidiumiodid; Abbildung 2 g) in den gleichen Proben. Einige konfokale Mikroskope sind mit einem spektralen Detektor ausgestattet, der die Fluoreszenz von mehreren Fluorophore sammeln können gleichzeitig und trennen sie danach. Wenn ein regulären Detektor muß jedoch ein Satz von Lasern und Filtern verwendet werden, um zu erregen und die Fluoreszenz von verschiedenen Fluorophoren zu trennen. Einige Fluorophore haben völlig unterschiedliche Emissionsspektren (zB GFP eind YFP) und kann gleichzeitig abgebildet werden. Andere Fluorophore haben teilweise überlappenden Emissionsspektren (zB GFP und YFP) und müssen in der Regel separat abgebildet werden sollen, die Belichtungszeit erhöht. Schließen Fluorophore oft Bebilderung erfordert auch beschränken, wie viel des Spektrums für jeden Kanal Fluoreszenz zu verhindern, dass ein Fluorophor aus undichten in einer anderen Kanal aufgefangen wird. Dies führt zu einem Verlust der Intensität des gesammelten Signals, das durch eine Erhöhung der Laserleistung und die Verstärkung kompensiert werden kann. Jedoch verlängerte Bildgebungszeit und eine erhöhte Laserleistung können Bleichmittel und / oder die Probe beschädigt werden. Eine erhöhte Laserleistung und / oder Verstärkung kann auch Hintergrundrauschen erhöhen. Optimierung der Signalintensität, die Auflösung und Abbildungszeit für jede Probe wird durch einen Trial-and-Error-Prozess durchgeführt und beinhaltet permanent Abwägungen.
Dieses Protokoll wird erklärt, wie Live-konfokale Abbildung der Blütenknospen an der Flanke eines seziert Spross Entwicklung durchzuführen. Eskann argumentiert werden, dass die Tatsache, dass die Triebspitze nicht mit dem Rest der Anlage verbunden ist und in einem Medium wächst Cytokinine enthalten könnte beeinflussen SAM und Blütenentwicklung. Jedoch wurde dieses Medium empirisch durch einen Trial-and-Error – Prozess entwickelt , um die sezierten shoot Apikalmeristemen produzieren neue Blütenknospen an der normalen Plastochron zu gewährleisten, und dass diese Blütenknospen der Regel 15 zu entwickeln. Ebenso hat Kelchblatt Dissektion nicht erscheinen zu Genexpressionsmuster oder die Entwicklung des Restes der Blüte zu beeinflussen. Andere Protokolle Detail , wie Live – konfokale Bildgebung des SAM auszuführen noch mit dem Rest der Anlage befestigt (zB Referenz 11). Solche Protokolle angepasst werden könnten, und bieten eine nützliche Alternative für die Abbildung Blumen zu entwickeln, insbesondere wenn Cytokinin bezogenen Prozesse zu studieren. Sie stellen jedoch mehrere Nachteile: die Schaft längt und Verdrehungen, und ändert die Ausrichtung der Blütenknospen; einnd während Abbilden einen Triebspitze mit dem Rest der Anlage angebracht funktioniert gut mit einem aufrechten Mikroskop ist es viel komplizierter, so mit einem inversen Mikroskop zu tun.
Immersionslinsen haben eine bessere numerische Apertur (NA) als „trocken“ Linsen (dh Linsen , die aus der Probe durch Luft getrennt sind) und daher eine feinere Auflösung der Probe zur Verfügung stellen, die kritisch ist , wenn ein konfokales Mikroskop. wodurch ein wasserabsorbierendes Tauchobjektiv bietet eine viel bessere NA als eine trockene Linse, während die Spitze während des Bilderzeugungsprozesses von dehydratisierenden shoot verhindern. Während Glycerin und Öl Linsen haben eine noch höhere NA als Wasserlinsen, erfordern sie die Verwendung eines Deckglases, das mit einer Probe von der Größe eines Spross sehr unpraktikabel ist, die auch wachsen während der Experimente Zeitraffer hält. Angesichts der Größe der Proben (in Abhängigkeit von den Blumenstufe Stapel kann mehr als 150 & mgr; m dick sein), ist es auch wichtig, eine Linse mit einem großen Arbeitsabstand zu verwenden,. Wir verwenden typischerweise ein 20 oder 40-fach-Objektiv mit einer NA von 1 und einem Arbeitsabstand von 1,7-2,5 mm.
Konfokalmikroskop Software bietet mehr Möglichkeiten konfokalen Daten sichtbar zu machen, einschließlich dreidimensionalen Rekonstruktionen (Abbildung 2, B1, B2 und B4) und Scheibe Ansichten (Figur 2, B3). Während die am häufigsten verwendeten dreidimensionalen Ansichten Maximumintensitätsprojektion des konfokalen Z-Stapels (2, B1 und B4) sind, irgendeine Software (zB ZEN und Imaris) bieten auch Ansichten Transparenz, die das Signal aus den tieferen Teilen filtern aus die Probe (2, B2), die nützlich sein können , wenn sie bei Prozessen stattfindet, oder Gene , ausgedrückt in, der epidermalen Schicht suchen. Signalintensität kann entweder mit einer einzigen Farbe (2, B1) codiert werden, unter Verwendung von Pixel intensity oder einen Farbcode (Abbildung 2, B4).
Live-konfokale Bildgebung nicht nur wertvolle qualitative Einblicke in der Blütenentwicklung bietet, sondern bietet auch potenziell Entwicklungsbiologen mit einer Fülle von quantitativen Daten. Verschiedene Software (zB Imaris, FiJi, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) erlaubt die Quantifizierung der Anzahl oder des Volumens der Zellen eine oder mehrere Reporter oder das Niveau der Expression eines Reporter in verschiedenen Zellen exprimiert. Solche Software kann auch eine automatische Zellsegmentierung durchführen verwendet werden, Zelllinien verfolgen und das Wachstum zu quantifizieren. Diese unterschiedliche Software bietet ähnliche Werkzeuge, unterscheidet sich aber auch in vielerlei Hinsicht. MARS-ALT und MorphoGraphX wurden 15 speziell für Anlagen konzipiert, 20, 21, im Gegensatz zu einem Imarisnd FiJi. MorphoGraphX erlaubt nur für die Segmentierung und Analyse der Epidermis, während Imaris und MARS-ALT für die Segmentierung und Analyse der gesamten Probe zu ermöglichen. Jedoch MARS-ALT erfordert die vorherige Abbildung der gleichen Probe , die von drei verschiedenen Winkeln 15 und Imaris erfordert nur einen einzigen Stapel. Der Zugriff auf quantitative Informationen ist entscheidend unser Verständnis der Blütenentwicklung zu fördern.
The authors have nothing to disclose.
Der Autor wünscht Prof. Elliot M. Meyerowitz für seine Unterstützung und Kommentare über das Manuskript, sowie Ann Lavanway am Dartmouth College und Dr. Andres Collazo an dem Biologische Imaging Facility am Caltech für ihre Hilfe bei der Lösung technische Probleme mit denen danken Live-konfokale Bildgebung. Nathanaël Prunet Arbeit wird von der US National Institutes of Health durch Grant-R01 GM104244 zu Elliot M. Meyerowitz unterstützt.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |