Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

1. Médias et plats Préparation Préparer des plats de dissection en remplissant des boîtes en plastique ronde (environ 6 cm de largeur, 2 cm de profondeur) de 0,5 cm à 2% d'agarose. Préparer des plats d' imagerie. Pour un microscope confocal en position verticale, à remplir des boîtes à charnière en plastique rectangulaire (environ 7 cm de long, 4,5 cm de large, 3 cm de profondeur) à 0,5 cm avec un milieu de formation d'image (voir la section 1.3, "moyen de création d'image", la figure 1F). Pour un microscope confocal inversé: remplir petite boîte de Petri (environ 3,5 cm de large, 1 cm de profondeur) exactement à ras bord par un milieu de formation d'image (voir la section 1.3, « moyen de création d'image », la figure 1G). Préparer le milieu de formation d'image. Pour l'imagerie en un seul point, en utilisant 1% d'agarose. Pour les expériences en accéléré, en utilisant un milieu de croissance de sommet (0,5 x mélange de sel basai de Murashige et Skoog sans vitamine, 1% de saccharose, 0,8% d'agarose, pH 5,8 avec de l'hydroxyde de potassiumsolution de e, complété avec de la vitamine [0,01% myo-inositol, 0,0001% d' acide nicotinique, 0,0001% de chlorhydrate de pyridoxine, 0,001% de chlorhydrate de thiamine, de la glycine 0,0002%] et la cytokinine [500 nM N6-benzyladénine]) 15. 2. la croissance des plantes Semer des graines stérilisées sur des plaques MS (0,5 ou 1x Murashige et le mélange de sel basai Skoog sans vitamine, 0,8% d'agar, pH 5,8 avec une solution d'hydroxyde de potassium) avec une sélection appropriée. Placer les plaques dans longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C Conditions pendant deux semaines. les jeunes plants sol avec un espacement ONTO suffisant pour permettre le développement robuste. Placez les plantes en jours courts, 16-22 ° C Conditions pour trois semaines. NOTE: La culture de plantes dans la journée ou les conditions de jour en continu directement après la transplantation conduit à une floraison prématurée et inflorescences qui sont moins vigoureux, et beaucoup plus difficiles à disséquer. De même, en laissant les plantes sous peu condit jourions pendant plus de trois semaines résultat en jours floraison longueur indépendante et inflorescences qui sont moins vigoureuses. plantes de transfert à longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C jusqu'à ce que les conditions qu'elles fleurissent. Pousses sont plus faciles à apex disséquer lorsque l'inflorescence est 2-10 cm de long. 3. Dissection de la séance photos Apex En option: En utilisant une pierre à aiguiser fine et une goutte d'huile légère, affûter une pince sous la loupe binoculaire pour les faire en forme de lame, non point comme. Retirer siliques, boutons de fleurs anciennes et inflorescences secondaires de l'inflorescence primaire en poussant la base des pédoncules avec la pince jusqu'à ce qu'ils cassent. Retirez autant de fleurs que possible sans grossissement (Figure 1, comparer A et B). En utilisant des pinces, percer un trou vertical dans l'agarose d'un plat de dissection, couper les derniers 0,5 cm de l'inflorescence et le coller verticalement dans l'agarose. Le resteboutons de fleurs doivent être au-dessus de la surface d'agarose. Remplissez le plat d'imagerie avec l'eau stérile désionisée de sorte que le sommet des pousses est complètement immergé. Placer le plat de dissection au microscope stéréoscopique, et enlever l'air emprisonné autour de l'apex de la tige en créant des jets d'eau avec une pipette de 1000 ul (figure 1, comparez C et D). Sous la loupe binoculaire, utilisez la pince pour enlever les bourgeons de fleurs qui ne sont pas à imager en poussant sur la base du pédoncule ou le haut du bourgeon jusqu'à la rupture de pédoncules (figure 1E). Il est important que les pédoncules cassent proprement à la jonction avec la tige, comme pédoncules restes empêchent l'enlèvement des jeunes bourgeons floraux. Si imagerie seulement boutons de fleurs de stade 5 et plus jeune (figure 2A), éliminer l'eau avant de disséquer stade 6-8 bourgeons de fleurs. Si les bourgeons de fleurs d'imagerie en scène 5 et plus, procéder à l'ablation sépales (voir rubrique 5.1). Dans le cas contraire, proCeed à l'étape 3.7. En utilisant des pinces, percer un trou vertical dans le milieu d'un plat de formation d'image, et coller le sommet disséqué en position verticale dans le milieu, de sorte que seul le méristème apical des pousses et entourant les boutons floraux sont au-dessus de la surface du support. Selon le bourgeon de fleur (s) sont à imager, il peut être nécessaire d'incliner légèrement l'échantillon, comme les boutons floraux sont orientés comme pas nécessairement exactement la tige (figure 2A). Procéder à la coloration de l'échantillon si nécessaire. Dans le cas contraire coloration et / ou l'imagerie de l'échantillon tout de suite, ajouter de l'eau et de fermer le plat d'imagerie pour prévenir la déshydratation. En cas d'utilisation d'un microscope inversé, placer la capsule d'imagerie dans une boîte en plastique transparent et la refermer. Figure 1: Préparation des pousses pour apex imagerie confocale en direct. (A – E) Dissection d'untirer sur le sommet pour l'imagerie. Inflorescences avant (A) et après (B) l' élimination des siliques et des fleurs plus. (C – D) apex de la tige immergée dans l' eau dans le plat de dissection, d'une bulle d'air emprisonnée à l'extrémité (C) et après le retrait de la bulle d'air (D). (E) Tirez sommet dans le plat disséquer, après dissection des bourgeons de fleurs de plus de stade 5. (F – G) Vue sur les sommets des pousses dans le plat d'imagerie, sur la scène d'un montant (F) et inversé (G) microscope confocal . Dans (F), une lentille d'immersion de l' eau 40X est positionnée au-dessus de l' un des sommets, avec la pointe de la lentille immergée dans l' eau. En (G), l'apex de la tige est positionnée à l' envers au-dessus de la lentille à immersion d'eau 40X, avec une colonne d'eau reliant le moyen de formation d'image à l'extrémité de la lentille. Le panneau inférieur en (F) montre une higsa vue en agrandissement de la zone dans le rectangle rouge, avec un apex de la tige insérée dans un milieu de formation d'image; lignes rouges et bleues indiquent la surface du support et de l'eau, respectivement. (H – I) Des exemples de dispositifs sur mesure qui permettent d' ajouter plus d' eau à l'extrémité de la lentille à immersion dans l' eau: un manchon de caoutchouc de silicone fabriqué à partir d' une cosse de bougie d'allumage (H), et un manchon de fortune fabriqué à partir du doigt d'un gant en latex poudrés (G). Les barres d'échelle = 0,5 cm de (A) et (B), 0,1 cm de (C) et (D), et 100 um (E). Ce chiffre a été initialement publié en référence 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 4. Staining REMARQUE: Les parois cellulaires ou les membranes plasmiques peuvent être colorées avec de l'iodure de propidium ou FM4-64, respectivement, pour parvenir à une résolution cellulairelors de l'imagerie. En variante, les lignes de rapporteurs fluorescents marqués avec des protéines sur la membrane de plasma peuvent être utilisées 6, 16. Enlever l'eau de la boîte d'imagerie, et de garantir la surface du support est sec pour éviter la dilution du colorant. Sous la loupe binoculaire, appliquer 20 à 30 pi de 1 mg / ml de solution d'iodure de propidium, ou 80 pg / ml de solution FM4-64 au sommet disséqué avec une pipette 10 ul. Assurez-vous que l'ensemble de l'échantillon est couvert de colorant pour assurer une coloration homogène. Colorer pendant 2 min si l'on utilise l'iodure de propidium, ou 20 min en cas d'utilisation FM4-64. Rincer deux fois avec de l'eau stérile déminéralisée. 5. sépales Ablation NOTE: À l'étape 4, sépales primordia commencent à couvrir le FM. Comme ils se développent, ils filtrent la fluorescence du tissu sous-jacent, et entravent le processus d'imagerie. Sépales peuvent soit être enlevés manuellement à l'aide d'une broche métallique Mounted sur un axe-étau, ou empêché de se développer en utilisant une ablation au laser sur les nouveaux primordia sépales. Sinon, il est possible dans certains cas , d'utiliser des mutants tels que apetala1-1, dans lequel sépales sont manquants ou remplacés par des feuilles ressemblant à des organes qui ne couvrent pas la FM tandis que la partie centrale de la fleur se développe normalement (figure 2F) 17. Ablation sépale sur les boutons floraux au stade 5 ou plus en utilisant un étau de broche tenant une aiguille métallique droite (Figure 2, E1-E2) Placez le plat disséquant avec le sommet disséqué sous la loupe binoculaire, et régler le grossissement au maximum. Immerger le sommet de la pousse dans l'eau stérile, déminéralisée, ou encore, utiliser une pipette de 1000 pi à appliquer de l'eau au sommet de la pousse régulièrement en disséquant les sépales. Avec la goupille-étau, positionner la broche au-dessus des sépales abaxial, tangentiellement par rapport au sommet de la pousse. Poussez doucement sépales loin du sommet de la pousse jusqu'à ce qu'il se détacheà partir du bourgeon de fleur. Procédez de la même avec sépales adaxial, mais pousser sépales vers le sommet des pousses. Procédez de la même avec les sépales latéraux, mais positionner la broche radialement par rapport au sommet de la pousse, et pousser les sépales sur le côté, loin du bourgeon de fleur. Immerger le sommet de la pousse dans l'eau stérile déminéralisée pendant quelques minutes pour prévenir la déshydratation. L' ablation laser de primordia sépale à l' étape 3-4 (Figure 2, C5-D5) Placez le plat d'imagerie avec le tachée, sommet disséqué sur la scène du microscope confocal. Localiser et de se concentrer sur le sommet que si la préparation de l'image (voir la section 6, « Configuration d'imagerie »). En utilisant le logiciel du système d'ablation laser, définir la zone d'ablation, ce qui correspond à la crête et la pointe du primordia sépales émergents avant qu'ils ne commencent à couvrir le méristème de fleurs (en général, à l'étape 3 pour sépales abaxiales et adaxiales, et à un stade avancé 3 / début étape 4 pour se latéralcopains). Réglez la puissance du laser et le temps de logement aux paramètres appropriés pour ablatent suffisamment de cellules sans infliger trop de dommages aux tissus sous-jacents. En règle générale, en fonction du système d'ablation laser utilisé, les paramètres appropriés doivent d'abord être identifiés par un processus d'essais et d'erreurs pour faire en sorte que suffisamment de cellules sont éliminées pour éviter que les sépales de se développer par la suite sur la FM, sans affecter le reste de la fleur bourgeon. En utilisant trop de puissance du laser et des logements résultats en temps en dommages au centre de la fleur, affectant la croissance et / ou la survie. Une fois que les paramètres appropriés ont été identifiés, ils peuvent être réutilisés pour des expériences ultérieures. NOTE: Si l'ablation initiale se révèle insuffisante, il est possible de procéder à une deuxième ablation les jours suivants (figure 2, C4 et D2). 6. Configuration Imaging Utilisez un microscope droit. <ol> Remplir la coupelle de formation d'image avec les sommets disséqués avec de l' eau stérile, désionisée de sorte que la surface du support est recouverte d'eau de 2,5 à 5 mm (figure 1F). Complètement immerger les échantillons. REMARQUE: Lors de l'imagerie avec un microscope droit, plusieurs sommets peuvent être placés dans le même plat d'imagerie. Toutefois, si le processus d'imagerie dure plus d'une heure, l'iodure de propidium a tendance à diluer, et quelques échantillons pourrait avoir besoin re-coloration avant l'imagerie. Placer le plat d'imagerie sur la platine du microscope (Figure 1F). Abaisser la lentille par immersion d'eau et d'élever la scène de telle sorte que la pointe de la lentille plonge dans l'eau. Procéder avec précaution afin de ne pas écraser les sommets disséqués ou tremper la lentille dans le milieu de formation d'image. Si une bulle d'air est emprisonné à la pointe de la lentille, faire des jets d'eau avec une pipette de 1000 pi pour le retirer. Sous illumination par épifluorescence, la position un des sommets disséqués dans le champ de la lentille à l'aide du XY conTroller. Regardez à travers les Oculaires et se concentrer sur l'échantillon en utilisant le contrôleur Z. Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l'échantillon. En utilisant le logiciel de microscope confocal, zoom sur le bouton de fleur à imager, et procéder à l'imagerie de votre échantillon. Utilisation d' un microscope inversé. En utilisant une pipette de 1000 pi, mettre une goutte d'eau stérile, déminéralisée à la pointe de la lentille. Tenez le plat d'image à l'envers, et avec une pipette de 1000 pi, ajouter une goutte d'eau stérile, déminéralisée au sommet disséqué. Placer le plat de formation d'image à l' envers sur la platine du microscope (figure 1G). Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l'échantillon. Sous éclairage à épifluorescence, positionner le sommet disséqué sur la pointe de la lentille à l'aide du contrôleur XY. Avec le contrôleur de Z, abaisser soigneusement l'étape jusqu'à ce que l'échantillon atteigne la goutte d'eau à l'extrémité de la lentille. Une colonne d'eau doit former between l'extrémité de la lentille et du milieu. Si la colonne d'eau ne forme pas, ajouter soigneusement une goutte d'eau à l'échantillon avec une pipette de 1000 pi. Ajouter des manches de fortune à la lentille afin d'ajouter plus d' eau à son extrémité, ce qui facilite la mise en place et le maintien de la colonne d'eau (Figure 1H et 1I). Sous l'éclairage de épifluorescence, regarder à travers les Oculaires et se concentrer sur l'échantillon en utilisant le contrôleur Z. Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l'échantillon. En utilisant le logiciel de microscope confocal, zoom sur le bouton de fleur à imager, et procéder à l'imagerie de l'échantillon. Si vous effectuez des expériences de laps de temps, verser l'eau sur le plat d'imagerie et le fermer pour prévenir la déshydratation entre des points de temps. Placer le plat de formation d'image avec les échantillons dans longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C conditions. échantillons reteindre avant chaque point de temps. REMARQUE: Alors que les cellules en déveping organes floraux peuvent se diviser plus rapidement, les cellules de la fracture florale méristème une ou deux fois tous les deux jours, et les lignées cellulaires sont faciles à suivre avec des points de temps toutes les 24 h. Cependant, le cas échéant, il est possible de l'image des échantillons toutes les six heures. 7. Considérations sur les paramètres d'imagerie NOTE: Comment configurer les paramètres d'imagerie dépend beaucoup du système confocal utilisé. Voici quelques suggestions pour certains de ces paramètres qui peuvent être utilisés avec un microscope confocal. Pour plus de considérations sur les paramètres d'imagerie, voir la section Discussion et référence 14. Pour la résolution XY: utiliser x 1,024 1,024 pour une bonne résolution cellulaire. Vous pouvez également utiliser 512 x 512 pour réduire le temps d'imagerie, au détriment de la résolution. Pour la résolution de Z: régler l'étape de taille de 0,5 à 1,5 pm. L'abaissement de l'étape de taille augmente la résolution de Z mais aussi le temps de formation d'image. <li> Pour le sténopé: régler le sténopé à 1-1,5 unités aérées. L'augmentation du sténopé augmente l'intensité du signal, mais aussi le bruit des avions non-focaux. 8. Visualisation des données confocale Tourner les images fixes de points de temps de développement des fleurs dans un film. Ouvrez les images fixes (en format JPEG ou TIF) dans le logiciel (par exemple, FIDJI). Aller à l'image> Stacks> Images à Stack. Les images ouvertes seront regroupées dans une pile. Si l'ordre des images de la pile ne correspond pas à l'ordre chronologique, utilisez le plugin Stack Sorter (plug-ins> Piles> Stack Sorter) pour les réorganiser. Pour activer la pile dans un film, allez dans Fichier> Enregistrer sous> AVI.