Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers
Summary
Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.
Abstract
De studie van de groei en ontwikkeling van planten is al lang vertrouwd op experimentele technieken met behulp van dode, gefixeerde weefsels en gebrek aan goede cellulaire resolutie. Recente ontwikkelingen in de confocale microscopie, gecombineerd met de ontwikkeling van een groot aantal fluoroforen, hebben deze problemen te overwinnen en opende de mogelijkheid om de expressie van verschillende genen tegelijk te bestuderen, met een goede cellulair resolutie, in levende monsters. Live confocale imaging biedt plantenbiologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen, en is uitgebreid gebruikt om wortelgroei en de vorming van laterale organen op de flanken van de shoot topmeristeem bestuderen. Het is echter niet op grote schaal toegepast op de studie van de ontwikkeling van de bloem, voor een deel te wijten aan de uitdagingen die specifiek zijn voor bloemen, zoals de kelkbladeren die groeien over de bloem meristeem beeldvorming, en filteren de fluorescentie van onderliggende weefsels zijn. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om live confocale beeldvorming uit te voeren op leven, het ontwikkelen van Arabidopsis bloemknoppen, met behulp van een rechtopstaande of een omgekeerde microscoop.
Introduction
Het grootste deel van de plant lichaam vormt post-embryonaal uit groepen van stamcellen gelegen aan of nabij de tip – of apicale meristemen – van de scheuten en wortels. Alle bovengrondse structuren van de volwassen planten afkomstig van de shoot apicale meristeem (SAM), die continu produceert laterale organen op de flanken: verlaat tijdens de vegetatieve fase en bloem meristemen (FMS) na het overgangen naar de reproductieve fase. FMs beurt ontwikkelen tot bloemen. Terwijl de SAM Arabidopsis produceert laterale organen één tegelijk, in een iteratieve, spiraalpatroon, FMs produceren vier soorten bloemorganen binnen vier kransen, in gedeeltelijk synchroon met meerdere ontwikkelingsprogramma's tegelijk ontrafelen. De genetische netwerken die ten grondslag liggen aan de specificatie van de identiteit van de verschillende bloemen organen zijn gedeeltelijk ontcijferd (voor overzichten, zie referenties 1, 2), maar veel aspecten van de bloem Development, zoals florale organen positionering en het bepalen van grenzen tussen kransen, blijven slecht begrepen.
Vroege moleculair genetische studies van plantenontwikkeling veelal gebruikt technieken zoals in situ hybridisatie en GUS reporters om genexpressie te analyseren. Hoewel deze methoden een schat aan informatie hebben verstrekt en in hoge mate bijgedragen aan ons begrip van de groei van planten en de ontwikkeling van de bloem, zijn er belangrijke beperkingen: ze missen een goede cellulaire resolutie, houden geen rekening met de gemakkelijke waarneming van de expressie patroon van meerdere genen in dezelfde monsters, en belangrijker, kan alleen worden toegepast op dood, gefixeerde weefsels. Recente ontwikkelingen in de confocale microscopie zijn deze beperkingen te overwinnen, en bieden ontwikkelingsstoornissen biologen met een krachtig hulpmiddel om de processen te onderzoeken onderliggende plantmorfogenese. In het bijzonder, confocale microscopie maakt het mogelijk voor de observatie van levende weefsels en organen gedurende hun vorming, dat is critical om volledig te begrijpen een typisch dynamisch proces, zoals de ontwikkeling.
Live confocale beeldvorming is uitgebreid gebruikt om de antenne groei van planten en de productie van laterale organen door SAM analyseren (bijv referenties 3, 4, 5, 6), maar met uitzondering van enkele gevallen (bijvoorbeeld referenties 7, 8, 9, 10), het is niet op grote schaal toegepast op de studie van de ontwikkeling van de bloem. Protocollen voor live-confocale beeldvorming van de SAM beschikbaar is (bv referenties 11, 12), en een goede basis voor de voorstelling van de ontwikkeling van bloemknoppen dat de SAM omringen. Echter, imaging bloemknoppen betreft de specifieke uitdagingen: bijvoorbeeld,bloemknoppen snel groter zijn dan SAM worden en in stadium 4, kelkbladen start voor de FM (stappen zoals beschreven in referentie 13), en dimmen van de fluorescentie van onderliggende weefsels (figuur 2A). Hier bieden we een gedetailleerd protocol waarin wordt uitgelegd hoe om live confocale beeldvorming uit te voeren op de ontwikkeling van Arabidopsis bloemknoppen met behulp van een rechtopstaande of een omgekeerde microscoop en een water dompelen lens. We hebben eerder gepubliceerde dit protocol in referentie 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een protocol voor de beeldvorming van leven, de ontwikkeling van Arabidopsis bloemknoppen met een confocale microscoop en een water dompelen lens. Hoewel dit kan worden gedaan met ofwel een rechtop of een omgekeerde microscoop, is het makkelijker en sneller aan de voormalige gebruiken. Het is ook vermeldenswaard dat verschillende confocale systemen aanzienlijk verschillen in termen van snelheid, gevoeligheid, en het vermogen om golflengten te scheiden. De beste confocale microscopen kunnen nu ook het aantal verschillende kanalen (bijvoorbeeld GFP, YFP, DsRed en propidiumjodide Figuur 2G) in dezelfde monsters. Sommige confocale microscopen zijn uitgerust met een spectrale detector, waarbij de fluorescentie van meerdere fluoroforen gelijktijdig kan verzamelen en vervolgens scheiden. Bij gebruik van een gewone detector echter een aantal lasers en filters worden gebruikt voor het exciteren en scheiden de fluorescentie van verschillende fluoroforen. Sommige fluoroforen hebben een volledig verschillende emissiespectra (bijvoorbeeld CFP eend YFP) en gelijktijdig worden afgebeeld. Andere fluoroforen zijn gedeeltelijk overlappende emissiespectra (bijvoorbeeld GFP en YFP), en gewoonlijk moeten apart af te beelden die afbeeldingstijd toeneemt. Beeldvorming sluit fluoroforen ook vereist vaak beperkt hoeveel van het spectrum wordt verzameld voor elk kanaal fluorescentie voorkomen ene fluorofoor lekt naar een ander kanaal. Dit veroorzaakt een verlies aan intensiteit van het opgevangen signaal, dat kan worden gecompenseerd door een toename van laservermogen en versterking. Echter kan langdurige beeldvorming en een hogere laservermogen bleken en / of beschadiging van het monster. Verhoogde laservermogen en / of versterking kan ook toenemen achtergrondgeluid. Optimalisatie van de intensiteit van het signaal, de resolutie en imaging tijd voor elk monster wordt gedaan door middel van een trial-and-error proces, en het gaat om permanente trade-offs.
Dit protocol wordt uitgelegd hoe om live confocale beeldvorming van bloemknoppen te ontwikkelen op de flanken van een ontleed shoot apex uit te voeren. Hetkan worden aangevoerd dat het feit dat de shoot apex niet is verbonden met de rest van de plant en groeit in een medium dat cytokines invloed kunnen zijn op SAM en de ontwikkeling van de bloem. Echter werd dit medium ontworpen empirisch via een trial-and-error proces om de ontleed shoot zorgen apicale meristemen produceren van nieuwe bloemknoppen op de normale plastochron, en dat deze bloemknoppen normaal 15 te ontwikkelen. Tevens laat kelkblad dissectie niet te genexpressie patronen of de ontwikkeling van de rest van de bloem beïnvloeden. Andere protocollen detail hoe levende confocale beeldvorming van de SAM voeren nog aan de rest van de plant (bijvoorbeeld referentie 11). Dergelijke protocollen kunnen worden aangepast aan, en bieden een bruikbaar alternatief voor de beeldvorming van de ontwikkeling van bloemen, in het bijzonder bij het bestuderen-cytokinine-gerelateerde processen. Ze bieden echter verschillende nadelen: de steel verlengt en draait, en verandert de oriëntatie van de bloemknoppen; eennd terwijl het afbeelden van een shoot apex gehecht aan de rest van de plant werkt goed met een rechtopstaande microscoop, is het veel ingewikkelder om dat te doen met een omgekeerde microscoop.
Immersielenzen een betere numerieke apertuur (NA) van "droge" lenzen (dwz lenzen die van het monster worden gescheiden door lucht) en daardoor een fijnere resolutie van het monster, wat essentieel is bij gebruik van een confocale microscoop. Onder toepassing van een water dompelen lens verschaft dus een veel betere NA dan een droge lens, terwijl het voorkomen van de shoot apex uitdrogen tijdens het belichtingsproces. Terwijl glycerine en olie lenzen hebben een nog hogere NA dan water lenzen, ze vereisen het gebruik van een dekglaasje, wat erg onpraktisch met een monster ter grootte van een shoot apex, die ook blijft groeien tijdens de time-lapse experimenten. Gezien de omvang van de monsters (afhankelijk van de florale stadium kan stapels dan 150 um dik), is het ook belangrijk om een lens met een lange werkafstand. We gebruiken meestal 20 of 40X objectief met een NA van 1 en een werkafstand van 1,7-2,5 mm.
Confocale microscoop software biedt verschillende manieren om confocale gegevens te visualiseren, waaronder drie-dimensionale reconstructies (Figuur 2, B1, B2 en B4) en uitzicht op de slice (figuur 2, B3). Terwijl de meest gebruikte drie-dimensionale aanzichten zijn maximale intensiteit projecties van de confocale Z-stacks (Figuur 2, B1 en B4), bepaalde software (bijv Zen en Imaris) bieden ook uitzicht transparantie filtert het signaal van de diepere delen van het monster (Figuur 2, B2), die nuttig kunnen zijn bij het zoeken naar processen plaatsvinden, of genen die tot expressie gebracht in de epidermale laag. Signaalintensiteit kan ofwel worden gecodeerd met een enkele kleur (Figuur 2, B1), met behulp pixel intensity, of met een kleurcode (figuur 2, B4).
Live confocale imaging biedt niet alleen waardevolle kwalitatieve inzichten in de ontwikkeling van de bloem, maar ook biedt potentieel ontwikkelingsstoornissen biologen met een schat aan kwantitatieve gegevens. Verschillende software (bijv Imaris, fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) maakt de kwantificering van het aantal of de hoeveelheid cellen die één of meerdere reporters of het expressieniveau van een reportergen in verschillende cellen. Dergelijke software kan ook worden gebruikt om de automatische cel segmentatie uit te voeren, te volgen cellijnen en groei te kwantificeren. Deze verschillende software biedt vergelijkbare instrumenten, maar ook verschilt op vele manieren. MARS-ALT en MorphoGraphX zijn speciaal ontwikkeld voor planten 15, 20, 21, in tegenstelling tot een Imarisnd Fiji. MorphoGraphX staat alleen de segmentatie en analyse van de epidermale laag, terwijl Imaris en MARS-ALT maken de segmentatie en analyse van het gehele monster. Echter, MARS-ALT de voorafgaande beeldvorming van hetzelfde monster vanuit drie verschillende invalshoeken 15 en Imaris vereist slechts een enkele stapel. Toegang tot kwantitatieve informatie is cruciaal voor ons begrip van de ontwikkeling van de bloem te bevorderen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur wenst te danken Prof. Elliot M. Meyerowitz voor zijn steun, en commentaar op het manuscript, evenals Ann Lavanway aan het Dartmouth College en Dr. Andres Collazo bij de Biological Imaging Facility bij Caltech voor hun hulp bij het oplossen van technische problemen met de Live confocale beeldvorming. werk Nathanaël Prunet wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health door middel van Grant R01 GM104244 Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
