Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes
Summary
A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.
Abstract
We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.
Introduction
Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como is�teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico 2, 3, 4. Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de moléculas estruturalmente e funcionalmente relevantes. Significativamente, no entanto, embora existam inúmeras vias sintéticas bem desenvolvidos para moléculas contendo areno disponíveis, apenas um número limitado de métodos para a síntese de azaborines foram relatados 9, 10, </s-se> 11, 12, 13. Isto é principalmente devido a um número limitado de opções para a fonte de boro e do ar e da natureza sensível à humidade da molécula na fase inicial da sequência sintética.
Na primeira parte deste artigo, iremos descrever uma síntese escala multi-grama de N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizando técnicas livre de ar padrão. Este composto serve como um intermediário versátil que pode ser adicionalmente funcionalizado para moléculas estruturalmente mais complexo 14, 15. A partir de 3, será descrita a síntese e purificação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5) para utilização em estudos de ligação de proteína. Devido à volatilidade de 5, o seu isolamento eficiente requer um controlo preciso da temperatura de reacção, tempo, e distilação condições.
Na segunda parte, os protocolos para a expressão da proteína e o isolamento de mutantes de T4 lisozima (L99A e L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 irá ser apresentada, seguido por cristalização de proteínas e preparação de complexos de cristais de proteína-ligando. Mutantes lisozima T4 e L99A L99A / M102Q foram escolhidos como sistemas modelo biológicos para examinar a capacidade de ligação de hidrogénio de moléculas contendo NH azaborine 17. Usando um protocolo padrão de biologia molecular, a proteína é expressa na estirpe Escherichia coli RR1 e induzidas com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). purificação de proteínas é realizada utilizando cromatografia em coluna de permuta iónica. cristalização de proteínas é realizada com uma solução altamente concentrada de proteína purificado (> 95% de pureza por electroforese em gel) usando a suspensãosoltar método de difusão de vapor. Devido à sensibilidade de ligandos deste estudo a oxigénio, os complexos proteína-ligando são preparados sob condições isentas de ar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados 12, 13. Triallylborane 22 foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.
Materials
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
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