Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

1. Isoler cellules isolées Préparer le microaspirator Retirez l'extrémité plastique transparent de l'ensemble de tube d'aspiration et insérer l'extrémité étroite à une extrémité d'un tube de PVC 1 pieds de long avec 3/16 "de diamètre intérieur. Insérer la sortie d'un filtre à seringue de 0,2 um dans l'autre extrémité de la tubulure en PVC 1 avec les pieds de long 6/3 "de diamètre intérieur. Insérer l'entrée du filtre à seringue de 0,2 um dans une extrémité d'un tuyau en PVC de 6 pouces de long avec 5/16 "de diamètre intérieur. Facultatif: Couper le tube de PVC 6 pouces de long avec 5/16 "de diamètre intérieur en deux et insérer un piège à eau en ligne entre les deux moitiés. Pause d'une pipette sérologique 5 ml en plastique à la graduation 1 ml et insérez l'extrémité cassée dans l'extrémité ouverte du tube en PVC avec 5/16 "de diamètre intérieur. Insérer la sortie de la pipette sérologique de 5 ml en matière plastique souple à l'extrémité d'un ensemble de tube d'aspiration (où l'extrémité en plastique transparentont été supprimés). Pour le stockage, recouvrir l'embout buccal rouge de l'ensemble de tube d'aspiration avec un tube en plastique stérile. Tirer un tube capillaire en verre à un diamètre intérieur de 10 à 30 um en portant le milieu du tube à proximité d'une flamme du bec Bunsen et appliquer une tension sur les deux extrémités du tube. Briser le tube étiré au milieu pour créer deux aiguilles d'aspiration potentiels. Répétez cette étape avec plusieurs tubes comme seuls quelques tubes finiront avec un diamètre intérieur qui est approprié pour la cueillette des cellules individuelles. Pour le stockage, placer deux bandes de pâte à modeler dans un plat de 15 cm de Pétri et fixer les aiguilles d'aspiration à travers les bandes. Choisissez cellules Préparer une suspension cellulaire unique comme il convient pour le type de cellule et d'expérimentation. Par exemple, pour préparer des cellules adhérentes telles que des lignées humaines de fibroblastes de cellules, les cellules de la récolte par des cellules trypsinisation et de transfert à un tube conique contenant les médias appropriés. Avant, pendant ouprès avoir préparation de la suspension unique de cellules (selon le temps qu'il faut pour préparer la suspension cellulaire unique), la configuration de la hotte pour l'amplification du génome entier. Vaporiser en bas de la surface de la hotte, les boîtes de pointes de pipettes et embouts de pipette avec 10% de l'eau de Javel et essuyer avec une serviette en papier. Répétez cette étape avec 70% d'éthanol. Ajouter 8 pi d'eau du kit d'amplification du génome entier (WGA) à des puits individuels d'une plaque de 96 puits PCR, un puits pour chaque cellule à séquencer. Couvrir le 96 puits plaque PCR avec un couvercle à partir d'une plaque de culture de tissus à 96 puits et placer sur la glace. Ajouter 1000 cellules à 10 ml de milieu ou tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de 15 cm de Pétri et placez le plat sur la glace pour empêcher les cellules d'adhérer à l'antenne. Apportez les cellules dans la boîte de Pétri et le 96-puits plaque PCR avec couvercle sur la glace à un microscope optique avec objectif 10X. Augmenter l'ouverture de l'aiguille d'aspiration en tapotant doucement l'extrémité tirée hors du ièmee aiguille d'aspiration sur une surface dure telle que la pointe se détache. Insérez l'extrémité large de l'aiguille d'aspiration dans l'extrémité claire de la microaspirator. Placez la boîte de Pétri contenant des cellules sur la platine du microscope. Placer l'embout buccal rouge de l'aspirateur dans la bouche. Utilisez une main pour déplacer l'aiguille d'aspiration et l'autre main pour déplacer la boîte de Pétri contenant des cellules. Identifier des cellules individuelles à séquencer. Utilisation de la bouche d'aspiration, dessiner une seule cellule dans l'aiguille d'aspiration ainsi que ~ 1-2 pi de médias ou de PBS. Transférer la cellule dans les 8 pi d'eau à l'intérieur d'un seul puits de la plaque de 96 puits PCR. Évitez d'introduire des bulles lors du transfert de la cellule. Répétez l'étape 1.2.7 jusqu'à ce que le nombre désiré de cellules ont été isolées. Gardez la plaque PCR sur la glace et recouvert de couvercle entre les cellules de cueillette. Marquez les puits qui ont reçu des cellules. Tout en ramassant des cellules individuelles, décongeler le seul 10X lyse des cellules et un tampon de fragmentation de l'ensemble du gkit d'amplification enome. Après avoir choisi le nombre désiré de cellules, procéder immédiatement à l'amplification du génome entier. 2. Whole Genome Amplification Pour éviter la contamination lors de l'amplification du génome entier, ajouter tous les réactifs dans une culture de tissu hotte, utiliser des embouts de pipette avec des filtres, et changer la pointe de la pipette entre les puits. Préparer une solution de travail d'un tampon de lyse et la fragmentation de la trousse d'amplification du génome entier (WGA). Pour chaque ensemble de 32 cellules, mélanger 32 pi de 10x lyse cellulaire unique et un tampon de fragmentation et 2 pl de solution de proteinase K dans un tube à centrifuger. Vortex le tube pour mélanger les solutions. Ajouter 1 pl de lyse et une solution tampon de fragmentation de travail à chaque puits et la pipette de haut en bas pour mélanger. Couvrir la plaque et sceller tous les puits avec un film plastique. Centrifuger brièvement la plaque dans une mini-plaque spinner. Cycle thermique comme follOWS: 50 ° C, 1 h et 99 ° C, 4 min. Refroidir la plaque sur la glace et centrifuger brièvement la plaque dans une mini-plaque spinner. Préparer une solution de tampon de préparation bibliothèque de travail de l'ensemble du kit d'amplification du génome. Pour chaque cellule, mélanger 2 pl de tampon 1x préparation de bibliothèque de cellules simples et 1 pl de solution de stabilisation bibliothèque dans un tube de microcentrifugation. Préparer la solution de travail à plusieurs cellules dans le même tube de microcentrifugation. Retirez le film plastique et ajouter 3 pi de solution de travail de tampon de préparation bibliothèque pour chaque puits. Pipeter le contenu du bien haut et en bas pour mélanger. Remplacer le film plastique. NOTE: Le film plastique peut être réutilisé pendant tout le processus d'amplification du génome jusqu'à ce que les puits commencent à percer des trous dans le film. Lorsque cela se produit, passer à un nouveau film plastique. Centrifuger brièvement la plaque dans une mini-plaque spinner et incuber à 95 ° C pendant 2 min. Refroidir la plaque sur la glace et brièvementcentrifuger la plaque dans une mini-plaque spinner. Retirez le film plastique, ajouter 1 pl bibliothèque enzyme de préparation à chaque puits, et la pipette le contenu du puits de haut en bas pour mélanger. Gardez l'enzyme de préparation bibliothèque sur la glace ou dans un bloc froid tout au long de cette étape. Remplacer le film plastique. Centrifuger brièvement la plaque en mini spinner de plaque et cycle thermique comme suit: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, et maintenir à 4 ° C. Refroidir la plaque sur la glace et centrifuger brièvement la plaque dans une mini-plaque spinner. Préparer une amplification mélange de travail de l'ensemble du kit d'amplification du génome. Pour chaque cellule, mélanger 48,5 ul d'eau, 7,5 ul 10x amplification mélange maître, et 5 ul d'ADN polymérase WGA dans un tube à centrifuger. Préparer le mélange travaillant pour plusieurs cellules dans le même tube de microcentrifugeuse. Gardez le mélange de travail sur la glace. Retirez le film plastique, ajouter 61 pi de travail amplification mixà chaque puits, et le contenu de la pipette de bien haut et en bas pour mélanger. Gardez l'amplification mélange de travail sur la glace ou dans un bloc froid tout au long de cette étape. Remplacer le film plastique. Centrifuger brièvement la plaque dans une mini-plaque spinner et cycle thermique comme suit: 95 ° C, 3 min, 25 cycles de 94 ° C, 30 sec et 65 ° C, 5 min, et maintenir à 4 ° C. Transfert de 60 pi de chaque échantillon à un tube de microcentrifugeuse séparé et stocker à – 20 ° C pour une utilisation à l'étape 3. Ajouter l' ADN du chargement de colorant sur le volume restant de chaque échantillon ( par exemple 3 pi de colorant de charge 6x ADN à 15 ul de l' échantillon) et exécuter 5 ul de chaque réaction sur un gel d'agarose à 1%. NOTE: Les cellules qui ont amplifié avec succès apparaîtra comme un frottis de 250 à 1000 pb. Les échantillons qui ne présentent pas un frottis ou seulement montrent un léger frottis sont peu susceptibles de produire des données de séquençage utiles. 3. séquençage Purifier échantillons avec des billes paramagnétiques. ThaLes échantillons d'ADN w sur la glace. des billes paramagnétiques vortex jusqu'à ce que la solution est homogène et incuber les billes à la température ambiante pendant au moins 30 min. Transférer 20 ul de chaque échantillon d'ADN dans un tube propre. Le reste de l'échantillon peut être stocké à -20 ° C. Ajouter 30 ul (1.5x) des billes paramagnétiques à chaque échantillon d'ADN et de vortex pour mélanger. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. Laissez la solution mère de perles à la température ambiante pour une utilisation à l'étape 3.4. Placer les tubes sur une bande de tube magnétique pendant 2 minutes, ou jusqu'à ce que les billes forment un culot et le surnageant est clair. En utilisant une pipette P200, enlever autant de surnageant que possible sans perturber les perles. Ajouter 180 ul de 80% d'éthanol au mélange ADN-perle. Faire tourner les tubes plusieurs fois par rapport à l'aimant de "rinçage" des perles à travers la solution d'éthanol. En utilisant une pipette P200, enlever autant de lavage à l'éthanol comme possible sans déranger les perles. Répétez 3.1.6 et 3.1.7. Air sécher les billes pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce que plus l'éthanol est visible. Passez à l'étape suivante lorsque les perles apparaissent fissurés ou tomber de la paroi du tube. Retirer les échantillons de la bande magnétique. Ajouter 40 pl de 10 mM de Tris, pH 8,0, pour éluer l'ADN à partir des billes et vortexer les échantillons pour remettre en suspension les billes. Incuber pendant 2 minutes à la température ambiante. centrifuger brièvement les échantillons pour collecter le liquide au fond du tube et placer les tubes sur une bande magnétique du tube pendant au moins deux minutes. Transférer l'éluant dans des tubes à centrifuger propres sans déranger les perles. normalisation Sample Quantifier la concentration de chaque échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre. Les concentrations devraient se situer entre 10 et 30 ng / pl. Diluer chaque échantillon à 0,2 ng / pl en utilisant 10 mM de Tris pH 8,0. Les étapes suivantes nécessiteront un i minimumnput de 5 pi de cette dilution. préparation Bibliothèque Préparer les bibliothèques de séquençage en suivant les instructions du kit de préparation de la bibliothèque 13. nettoyage final Nettoyer les échantillons selon l'étape 3.1. Pour des longueurs de lecture de 50 pb, 75 pb ou 150 pb, utiliser un rapport de bourrelet à volume de 1,5x, 1x ou 0.6x échantillon, respectivement. Éluer avec 15 ul de 10 mM de Tris pH 8,0. Exécutez les échantillons sur un analyseur de fragment pour vérifier la distribution de la taille de la bibliothèque 14. La distribution de la taille doit être répartie uniformément 150-900 pb. Quantifier les échantillons en utilisant qPCR L' utilisation d' un kit de quantification bibliothèque, mettre en place une réaction qPCR selon les instructions du kit 15. Laisser une ébauche de colonne pour ajouter des normes positives (normes d'ADN du kit) et des normes négatives (eau ou autre solution à blanc). Cycle thermique Assembas: 95 ° C, 5 min (vitesse de rampe de 4,8 ° C / s) et 35 cycles de 95 ° C, 30 sec (vitesse de rampe de 4,8 ° C / sec) et 60 ° C, 45 sec (taux de 2,5 rampe ° C / sec). mise en commun Déterminer le nombre de voies sur la cuve à circulation sont nécessaires et divisent les échantillons en groupes, avec un groupe par voie. Pour chaque groupe d'échantillons, pour choisir l'échantillon avec la concentration la plus faible sur la base des données provenant de l'étape qPCR 3.5.2 et normaliser tous les échantillons dans ce groupe pour que la concentration en utilisant 10 mM de Tris pH 8,0. Réunir les échantillons dans chaque groupe ensemble. séquençage Pools de charge sur la prochaine génération de machines de séquençage suivantes procédures standard 16. Analyse 4. Données NOTE: Un environnement basé sur Unix est requis pour exécuter les programmes et les scripts de cette section. Installez le logiciel mentionné dans le protocole suivant leur en guides d'ins-. Tous les scripts peuvent être trouvés à https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. Coupez le lit à 40 nt en utilisant fastx_trimmer de la version FASTX-Toolkit 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq Alignez le lit au génome approprié de référence (mm9 pour la souris, hg19 pour l' homme) en utilisant la version 0.6.1 BWA avec les options par défaut 18. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Retirer les alignements de CHRM et chromosomes aléatoires, puis trier et indexer le fichier BAM résultant en utilisant la version 0.1.19 samtools 19. grep -v -w CHRM example.sam | aléatoire> example.filtered.sam -v grep samtools voir example.filtered.sam -uSh | samtools tri – example.filtered samtools index example.filtered.bam Exécutez HMMcopy pour détecter CNV= "Xref"> 20 Utilisez gcCounter dans HMMcopy pour générer un fichier de référence en pourcentage de GC pour le génome. Utilisez l'option "-w 500000" pour spécifier la taille de la fenêtre. Utilisez la même version du fichier de référence fasta utilisé dans l'étape 4.2, mais assurez-vous CHRM et les chromosomes aléatoires sont retirés du fichier FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig Utilisez generateMap.pl dans HMMcopy pour générer un fichier de manœuvre pour cartographiabilité. Utilisez l'option "-w 40" pour spécifier la longueur lue. Utilisez le même fichier de référence fasta utilisé dans l'étape 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig Utilisez mapCounter dans HMMcopy pour générer un fichier de référence de cartographiabilité pour le génome. Utilisez l'option "-w 500000" pour spécifier la taille de la fenêtre. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Utilisez ReadCounter dans HMMcopy pour générer un fichier de manoeuvre pour chaque fichier BAM. ReadCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </li> Modifiez les chemins d'accès aux fichiers de référence dans les scripts de R (run_hmmcopy.mm9.r ou run_hmmcopy.hg19.r), utiliser les fichiers générés ci – dessus en 4.4.1 (par exemple, mm9_gc.wig) et 4.4.3 (par exemple, mm9_map. perruque) pour les variables gfile et MFILE, qui se réfèrent au fichier de fichier de référence en pourcentage de GC et la référence de cartographiabilité, respectivement. Ensuite, exécutez le script R fourni "de run_hmmcopy.mm9.r" ou "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r ou R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r Pour le traitement d'un ensemble de fichiers BAM par lots, mettre les fichiers BAM dans un seul dossier et exécutez le script fourni "HMMpipe.pl" dans le paquet pour appeler des segments et calculer les scores de variabilité (VS). Suivez le format: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9 Exécutez DNAcopy pour détecter CNV 21. Utilisez samtools la version 0.1.19 pour extraire mappé unique lit de chaque fichier BAM. samtools voir -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools voir -SHU -> example.mapped.bam Utilisez MarkDuplicates dans Picard Version 1.94 pour marquer les doublons de PCR dans le BAM fichier 22. java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam OUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true Utilisez coveragebed dans bedtools la version 2.17.0 de compter mappé lit dans chacune des fenêtres de cartographiables de 500kb dynamique prédéfinis dans le fichier BED fourni "de mm9.500k.dynamic.win.bed" ou "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | Tri -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts Utilisez le script Perl fourni "normalizeGC.pl" pour normaliser les chiffres de lecture sur la base du fichier de référence fourni de contenu GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" ou "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ". perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts Utilisez le R script "dnacopy.r" fourni pour appeler les segments. R CMD BATCH dnacopy.r Identifier CNV Exclure les cellules pour lesquelles le VS calculé 4.4.6 dépasse 0,26. Filtrer les segments appelés par HMMcopy en 4.4.6 pour inclure uniquement ceux pour lesquels le ratio médian log 2 est supérieur à 0,4 (gain putative) ou inférieure à -0,35 (perte putative). Filtrer les segments appelés par DNAcopy à 4.5.5 pour inclure seulement ceux pour lesquels le segment moyenne est supérieure à 1,32 ou inférieur à 0,6. Superposer les segments de 4.6.2 et 4.6.3, appelant CNV seulement dans les régions où les deux HMMcopy et DNAcopy identifient un gain ou une perte putative putatif.