Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

1. Het isoleren van enkele cellen Bereid de microaspirator Verwijder de doorzichtige plastic uiteinde van de aspirator buisstelsel en steek het smalle uiteinde in een uiteinde van een 1 cm lange PVC buis met 3/16 "binnendiameter. Plaats de uitlaat van een 0,2 urn spuitfilter in het andere uiteinde van de 1 cm lange PVC buis met 3/6 "binnendiameter. Steek de inlaat van de 0,2 urn spuitfilter in een einde van een 6 inch-lange PVC buis met 5/16 "binnendiameter. Optioneel: Snijd de 6 inch-lange PVC buis met 5/16 "binnendiameter in de helft en plaats een in-line water val tussen de twee helften. Breek een 5 ml plastic serologische pipet op 1 ml graduatie en plaats het gebroken uiteinde in het open uiteinde van de PVC buis met 5/16 "binnendiameter. Plaats de uitlaat van het 5 mL plastic serologische pipet in het flexibele uiteinde van een aspirator eenheid (waarbij de doorzichtige plastic eindewas verwijderd). Voor de opslag, hebben betrekking op de rode spreekbuis van de aspirator buis montage met een steriele plastic buis. Trekken uit een glazen capillair met een inwendige diameter van 10-30 urn doordat zij het midden van de buis bij een Bunsen brander vlam en toepassen spanning op beide uiteinden van de buis. Breek de buis getrokken in het midden om twee potentiële aspirator naalden te creëren. Herhaal deze stap met een aantal buizen, aangezien slechts enkele buizen zal eindigen met een inwendige diameter die geschikt is voor het plukken van enkele cellen is. Voor de opslag, plaats twee stroken van boetseerklei in een 15 cm petrischaal en zet de aspirator naalden over de strips. Pick-cellen Bereid een enkele cel schorsing afhankelijk van het type cel en experiment. Bijvoorbeeld om hechtende cellen te bereiden zoals humane fibroblast cellijnen oogst cellen door behandeling met trypsine en overdracht cellen om een ​​conische buis met geschikte media. Voor, tijdens offter de voorbereiding van de enkele cel suspensie (afhankelijk van hoe lang het duurt om de enkele celsuspensie te bereiden), het instellen van de kap voor de hele genoom amplificatie. Spray beneden het oppervlak van de kap, pipetpunt dozen, en de pipet tips met 10% bleekwater en veeg met een papieren handdoek. Herhaal deze stap met 70% ethanol. Voeg 8 pi van water uit het hele genoom amplificatie (WGA) kit afzonderlijke putjes van een 96-well PCR plaat, één putje voor elke cel waarvan de sequentie. Bedek de 96-well PCR plaat met een deksel van een 96-well weefselkweekplaat en plaats op ijs. Voeg 1000 cellen aan 10 ml media of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 15 cm petrischaal en plaats de schotel op ijs te voorkomen dat de cellen hechten aan de schaal. Breng de cellen in een petrischaal en de 96-well PCR plaat met deksel op ijs om een ​​licht microscoop met 10x objectief. Verhoog de opening van de aspirator naald door voorzichtig de uitgesponnen eind van Th tikkene aspirator naald op een hard oppervlak, zodanig dat de punt afbreekt. Steek het brede uiteinde van de aspirator naald in de heldere einde van de microaspirator. Plaats de petrischaal met cellen op de microscoop podium. Plaats de rode mondstuk van de aspirator in de mond. Met één hand de naald aspirator en anderzijds naar de petrischaal met cellen bewegen. Identificeer enkele cellen waarvan de sequentie. Met behulp van mond zuigkracht, trek een enkele cel in de aspirator naald samen met ~ 1-2 pi van media of PBS. Breng de cel in de 8 pi water in een enkel putje van de 96-well PCR plaat. Voorkomen dat er luchtbellen bij de overdracht van de cel. Herhaal stap 1.2.7 tot het gewenste aantal cellen zijn geïsoleerd. Houd de PCR-plaat op ijs en bedekt met deksel in tussen plukken cellen. Markeren de putten die cellen hebben ontvangen. Terwijl het oppakken enkele cellen, ontdooien de 10X enkele cel lysis en fragmentatie buffer uit de hele genome amplificatie kit. Na het kiezen van de gewenste aantal cellen, gaat onmiddellijk op hele genoom amplificatie. 2. Whole Genome Amplification Om besmetting tijdens de gehele genoom amplificatie te voorkomen, voeg alle reagentia in een weefselkweek kap, gebruiken pipet tips met filters, en verander de pipet tip in tussen de putten. Bereid een werkende lysis en fragmentatie bufferoplossing uit het hele genoom amplificatie (WGA) kit. Voor elke set van maximaal 32 cellen combineren 32 ui 10x cel lysis en fragmentatie buffer en 2 pl proteinase K oplossing in een microcentrifugebuis. Vortex de buis om de oplossingen te mengen. Voeg 1 pl werken lysis en fragmentatie bufferoplossing aan elk putje en pipet op en neer te mengen. Bedek de plaat en sluit alle putjes met een plastic folie. Kort centrifuge de plaat in een mini plaat spinner. Thermische cyclus als follows: 50 ° C, 1 h en 99 ° C, 4 min. Koel de plaat op ijs en kort centrifuge de plaat in een mini-plaat spinner. Bereid een werkende bibliotheek voorbereiding bufferoplossing uit het hele genoom amplificatie kit. Voor elke cel, combineer 2 pl 1x cel bibliotheek bereiding buffer en 1 pi van bibliotheek stabilisatie oplossing in een microcentrifugebuis. Bereid de werkoplossing meerdere cellen in dezelfde microcentrifugebuis. Verwijder de plastic film en voeg 3 pl werkbibliotheek preparaat bufferoplossing aan elk putje. Pipetteer de inhoud van de put op en neer om te mengen. Vervang de kunststoffolie. OPMERKING: De kunststoffilm kan worden hergebruikt gedurende het gehele genoom amplificatieproces totdat de putjes gaan boringen in de film. Wanneer dit gebeurt, overschakelen naar een nieuwe plastic folie. Kort centrifuge de plaat in een mini spinner plaat en incubeer bij 95 ° C gedurende 2 minuten. Koel de plaat op ijs en in het kortcentrifuge de plaat in een mini plaat spinner. Verwijder de plastic folie, voeg 1 pl bibliotheek enzympreparaat aan elk putje en pipet de inhoud van de put op en neer te mengen. Houd de bibliotheek voorbereiding enzym op ijs of in een koude blok in deze stap. Vervang de kunststoffolie. Kort centrifuge de plaat in mini plaat spinner en thermische cyclus als volgt: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, en houden op 4 ° C. Koel de plaat op ijs en kort centrifuge de plaat in een mini-plaat spinner. Bereid een werkende versterking mix van het hele genoom amplificatie kit. Voor elke cel, combineer 48,5 pi water, 7.5 pi 10x versterking master mix, en 5 pi WGA DNA polymerase in een microcentrifugebuis. De werkoplossing mix meerdere cellen in dezelfde microcentrifugebuis. Houd de werkende mix op ijs. Verwijder de plastic folie, voeg 61 ul werken versterking mixaan elk putje, en de inhoud van de pipet goed op en neer om te mengen. Houd de werkende versterking mix op ijs of in een koude blok in deze stap. Vervang de kunststoffolie. Kort centrifuge de plaat in een mini plaat spinner en thermische cyclus als volgt: 95 ° C, 3 min, 25 cycli van 94 ° C, 30 sec en 65 ° C, 5 min, en houden op 4 ° C. Overdracht 60 pi van elk monster een aparte microcentrifugebuis en opslag bij – 20 ° C voor gebruik in stap 3. Voeg DNA laadkleurstof het resterende volume van elk monster (dat wil zeggen 3 pi van 6x DNA laadkleurstof tot 15 pl monster) en in werking 5 pi van elke reactie op een 1% agarosegel. OPMERKING: Cellen die met succes versterkt zal verschijnen als een uitstrijkje van 250 tot 1000 bp. Monsters die geen uitstrijkje hebben laten zien of alleen laten een zwakke uitstrijkje is onwaarschijnlijk dat bruikbare sequencing data opleveren. 3. Sequencing Zuiver monsters met paramagnetische kralen. Thaw DNA-monsters op ijs. Vortex paramagnetische kralen tot de oplossing homogeen en incubeer de korrels bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min. Transfer 20 pi van elk DNA monster in een schone microcentrifugebuis. De rest van het monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C. Voeg 30 pi (1,5x) van paramagnetische kralen aan elk DNA-monster en vortex te mengen. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laat de voorraadoplossing van kralen bij kamertemperatuur voor gebruik in stap 3,4. Plaats de buizen op een magnetische strip buis gedurende 2 minuten of totdat de korrels vormen een pellet en het supernatant helder. Met behulp van een pipet P200, verwijder zoveel van de supernatant mogelijk zonder de kralen. Voeg 180 ui 80% ethanol om het DNA-korrel mengsel. meermaals opzichte van de magneet "spoelen" de kralen door de ethanoloplossing draaien de buizen. Met behulp van een pipet P200, verwijder zoveel mogelijk van de ethanol wassen als mogeble zonder verstoring van de kralen. Herhaal 3.1.6 en 3.1.7. De lucht drogen de kralen gedurende ongeveer 10 minuten of tot er geen ethanol meer zichtbaar is. Naar de volgende stap bij de parels verschijnen gebarsten of de wand van de buis vallen. Verwijder de monsters van de magneetstrip. Voeg 40 ul van 10 mM Tris pH 8,0 met het DNA van de bolletjes elueren en vortex de monsters om de kralen resuspenderen. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Kort Centrifugeer de monsters om de vloeistof op de bodem van de reageerbuis te verzamelen en plaats de buizen op een magnetische strip buis gedurende ten minste twee minuten. Breng de eluent in schone microcentrifugebuizen zonder verstoring van de kralen. sample normalisatie Kwantificeren van de concentratie van elk monster onder toepassing van een spectrofotometer. De concentraties moet liggen van 10 tot 30 ng / ul. Verdun elk monster tot 0,2 ng / ul gebruikt 10 mM Tris pH 8,0. De volgende stappen zullen een minimum ik vereisennput van 5 pi van deze verdunning. voorbereiding bibliotheek Bereid sequencing bibliotheken door de instructies van de bibliotheek voorbereiding kit 13. eindschoonmaak Reinig de monsters volgens stap 3,1. Gelezen lengte van 50 bp, 75 bp of 150 bp, gebruiken een verhouding van kraag naar volume 1,5x, 1x of 0.6x monster, respectievelijk. Elueer met 15 ui 10 mM Tris pH 8,0. Run de monsters op een fragment analysator om de grootteverdeling van de bibliotheek 14 controleren. De grootteverdeling wordt gelijkmatig verdeeld 150-900 bp. Kwantificeren monsters met behulp van qPCR Met behulp van een bibliotheek kwantificering kit, opzetten van een qPCR reactie volgens de kit instructies 15. Laat een kolom leeg om positieve normen (DNA normen uit de kit) en negatieve normen (water of andere blanco-oplossing) toe te voegen. Thermische cyclus als follows: 95 ° C, 5 min (toenamesnelheid van 4,8 ° C / sec) en 35 cycli van 95 ° C, 30 sec (toenamesnelheid van 4,8 ° C / sec) en 60 ° C, 45 sec (toenamesnelheid van 2,5 ° C / sec). pooling Bepalen hoeveel rijstroken op de doorstroomcel nodig zijn en verdeel de monsters in groepen, waarbij één groep per rijstrook. Voor iedere groep, kiest het monster met de laagste concentratie op basis van de qPCR gegevens uit stap 3.5.2 en normaliseren alle monsters in die groep die concentratie waarbij 10 mM Tris pH 8,0. de monsters in elke groep samen te bundelen. sequencing Load zwembaden op next-generation sequencing machine volgens standaardprocedures 16. 4. Data Analysis OPMERKING: Een Unix-gebaseerde omgeving is vereist om de programma's en scripts in dit gedeelte werking. Installeer de in het protocol genoemde software na hun in stallatie gidsen. Alle scripts zijn te vinden op https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. Knip de leest 40-nt met behulp van fastx_trimmer van FastX-Toolkit versie 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq l 40 -o example.trim.fastq Lijn de leest om de juiste verwijzing genoom (MM9 voor muis, hg19 voor menselijke) met behulp van BWA versie 0.6.1 met standaardopties 18. BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Verwijder Alignmenten Chrm en willekeurige chromosomen, dan sorteren en de index van de resulterende BAM-bestand met SAMTools versie 0.1.19 19. grep -v -w Chrm example.sam | grep -v willekeurige> example.filtered.sam samtools bekijken -uSh example.filtered.sam | samtools sort – example.filtered samtools index example.filtered.bam Ren HMMcopy om CNVs detecteren= "Xref"> 20 Gebruik gcCounter in HMMcopy een GC percentage referentiebestand voor het genoom te genereren. Gebruik de optie '-w 500000 "om het venster formaat op te geven. Gebruik dezelfde versie van het FASTA referentiebestand gebruikt in stap 4.2, maar zorg ervoor dat Chrm en willekeurige chromosomen worden verwijderd uit de fasta bestand. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig Gebruik generateMap.pl in HMMcopy een wiebelen bestand voor mappability genereren. Gebruik de optie "-w 40" om aan te geven te lezen lengte. Gebruik dezelfde FASTA referentiebestand gebruikt in stap 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40-i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig Gebruik mapCounter in HMMcopy een mappability referentiebestand voor het genoom te genereren. Gebruik de optie '-w 500000 "om het venster formaat op te geven. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Gebruik readCounter in HMMcopy een wiebelen bestand voor elk BAM bestand te genereren. readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </li> Wijzig de paden naar de referentie-bestanden in de R scripts (run_hmmcopy.mm9.r of run_hmmcopy.hg19.r), gebruikt u de bovenstaande bestanden gegenereerd in 4.4.1 (bijv mm9_gc.wig) en 4.4.3 (bijv mm9_map. pruik) voor de variabelen GFile en mfile, die verwijzen naar de GC percentage referentiebestand en mappability referentiebestand, respectievelijk. Dan start de meegeleverde R script "run_hmmcopy.mm9.r" of "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r of R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r Voor de batchverwerking van een reeks van BAM-bestanden, zet de BAM-bestanden in één map en voer de meegeleverde script "HMMpipe.pl" in het pakket aan segmenten te bellen en te berekenen variabiliteit scores (VS). Volg het formaat: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 Ren DNAcopy om CNVs 21 detecteren. Gebruik SAMtools versie 0.1.19 te extraheren unieke wijze in kaart gebracht leest van elk BAM bestand. samtools bekijken -h-F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools bekijken -shū -> example.mapped.bam Gebruik MarkDuplicates in Picard versie 1.94 markeren PCR duplicaten in het BAM-dossier 22. java-jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam uitgang = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true Gebruik coveragebed in bedtools versie 2.17.0 te tellen in kaart gebracht leest in elk van de vooraf gedefinieerde dynamische 500kb mappable ramen in de verstrekte BED bestand "mm9.500k.dynamic.win.bed" of "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sort -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts Gebruik de meegeleverde Perl-script "normalizeGC.pl" om de read tellingen op basis van de GC inhoud referentiebestand "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" of "hg19.500k.dynamic.win.fa normaliseren. gc.txt ". perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts Gebruik de meegeleverde R script "dnacopy.r" om de segmenten te bellen. R CMD BATCH dnacopy.r Identificeer CNVs Uitsluiten cellen waarvoor de VS berekende 4.4.6 groter is dan 0,26. Filter de segmenten genoemd HMMcopy in 4.4.6 tot alleen die waarvan de gemiddelde log 2 verhouding groter is dan 0,4 (vermeende gain) of kleiner dan -0,35 (vermeende verlies). Filter de segmenten genoemd DNAcopy 4.5.5 daarvan alleen die waarvoor het segment gemiddelde groter dan 1,32 of kleiner dan 0,6. Overlappen de segmenten van 4.6.2 en 4.6.3, roepen CNVs alleen in gebieden waar beide HMMcopy en DNAcopy identificeren van een vermeende winst of vermeende verlies.