在子宫内电途径研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接
Summary
这份手稿规定， 在子宫内电（IUE）用来描述在单细胞水平与荧光标记的神经元兴奋性神经元的结构连接协议。组织学是用于表征树突和轴突突起。在急性切片全细胞记录被用来研究兴奋性。
Abstract
神经系统是由不同的神经元类型的一个巨大的范围。这些神经元亚群的特征在于，其它的特征，其独特的树突形态，其轴突连通的特定的模式，和它们的选择性点火的反应中。负责开发期间分化的这些方面的分子和细胞机制仍然知之甚少。
在这里，我们描述了联合协议标签和表征皮层神经元的结构连接性和兴奋性。在子宫内电（IUE）协议的修改使得神经元人口稀少的标签。这，反过来，使树突和单个神经元，轴突突起的层位置的精确表征，和形态分析的轴突的识别和跟踪。 IUE也可以用来研究在的兴奋性变化野生型（WT），或通过将其与全细胞记录从电脑的急性切片结合遗传修饰的神经元。这两种技术有助于更好地理解的结构和功能连接的耦合和分子机制控制发育过程中的神经元的多样性。这些发育过程对轴突布线，神经元的功能的多样性，以及认知障碍的生物学重要的影响。
Introduction
树突和轴突结构的发展是电路调节在神经系统中的一个重要方面，包括在大脑皮层。它起着多样化神经元亚群的选择性布线过程中起关键作用。若干最近的报告表明，除了连接性，神经元的分子多样性由获取烧成的高度特异性的方式体现出来。然而，机制确定发育过程中不同的神经元亚型的兴奋性和连接性，以及它们的协调程度，仍然知之甚少1,2。
体内损失-和增益的功能分析允许对特定基因的表达水平和其在电路的发展的影响之间的关系的研究。 在子宫内电（IUE）是广泛用于研究的技术在特定神经元群体的兴趣的基因的功能，并研究它们的连接的总体图案。然而，为了确定在活的小鼠轴突和树突皮质层的形态特征，是必不可少的疏标记神经元。一个的Cre重组系统用IUE组合可用于在足够低的密度来标记的神经元的稀疏人口来解析所识别的皮质椎板的各个细胞发出的突起。此方法标记足够数目的每皮质神经元的电脑（ 图1）的合理数量的分析之后，得到定量数据。这份手稿提出了连通性等精细分析的方法。它也提供了一个类似的策略来分析，在单独的实验中，通过在绿色荧光蛋白（GFP）进行电流钳记录神经元的电性能-electroporated从急性皮层切片的细胞。这些亲母育酚是通用的，可以适用于WT和转基因动物的神经元的兴奋性和连通性的研究中，以及在其损失和功能增益由附加质粒IUE期间引入神经元。
虽然该协议描述了在胚胎天（E）15.5小鼠的电穿孔，该技术可以在任何年龄E9.5 3和日龄（P）的2 4之间执行。虽然电在早期阶段目标的神经元和丘脑的前体和皮质的深层，后期电痕更多的表层（如 E15.5 IUE目标层II-III神经元）。总之，IUE的具有单细胞形态学分析和电的组合是阐明在神经系统的基本神经元的巨大结构和功能的多样性的分子机制的有用工具。
Protocol
所有动物的程序是由马德里动物护理和使用委员会，共同体符合国家和欧洲法规认可（PROEX一十四分之一百十八; PROEX15分之331）。保持在手术过程中在无菌条件。 1. 在子宫内的电注意：此协议为Iue时从先前已公布的5，6，7更为适合。该原稿描述了一种协议，用于E15.5的IUE的胚胎，…
Representative Results
为了表征在细节和整个开发神经元的形态变化，有必要稀疏标记神经元。一个Cre重组稀释系统允许感兴趣的基因在神经元的人口稀少的表达，因此，只有那些掺入这种酶的神经元表达GFP（ 图1A）。使用这种策略，层II-III是针对在E15.5通过IUE标记。 CAG-的DsRed2在1微克/μL，是共电为控制和动物活体识别正面电大脑。重要的是，抗GFP抗体染色后，信号足够强，让他?…
Discussion
这个协议在详细描述了如何标记C75BL / 6小鼠的躯体感觉皮层的神经元，以分析它们的连接和它们的兴奋性。相对于现有的方法，它可视连通的识别方面，如每神经元轴突的分支数，它们的精确地形，和它们的解剖位置。通过改变电极的位置，有可能指定其他神经元群体，如扣带皮层（保持电极和大脑之间的角度相同，但改变磁极的取向）或海马5，并且执行类似实验标记单个神经…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢R.古铁雷斯和A.莫拉莱斯的出色技术援助和洛杉矶魏斯进行编辑。 CGB是由西班牙部：西恩西亚ËINNOVACIÓN（MICINN），FPI-BES-2012-056011资助。这项工作是由来自BBVA基金会和SAF2014-58598-JIN（MINECO）到M.纳瓦雷特的资助，并从拉蒙阿雷塞斯基金会和赠款SAF2014-52119-R和BFU2014-55738-REDT（从MINECO）向基金资助M.涅托。
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
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Cite This Article
Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), e55139, doi:10.3791/55139 (2017).