في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية
Summary
توفر هذه المخطوطة البروتوكولات التي تستخدم في الرحم Electroporation لل(IUE) لوصف الربط الهيكلي للخلايا العصبية على مستوى وحيدة الخلية واستثارة الخلايا العصبية fluorescently المسمى. يستخدم الأنسجة لتوصيف شجيري والتوقعات محور عصبي. يستخدم تسجيل كامل الخلية في شرائح حادة لتحقيق استثارة.
Abstract
ويتكون الجهاز العصبي من مجموعة ضخمة من أنواع الخلايا العصبية واضحة. وتتميز هذه القطعان العصبية، من بين الميزات الأخرى، الأشكال التضاريسية شجيري المتميزة، أنماط محددة من الربط محور عصبي، وردود اطلاق انتقائية بهم. لا تزال غير مفهومة الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن هذه الجوانب من التمايز خلال التنمية.
هنا، نحن تصف بروتوكولات مشتركة لوضع العلامات وتميز الربط الهيكلي واستثارة الخلايا العصبية القشرية. تعديل في الرحم Electroporation لل(IUE) بروتوكول يسمح بوضع العلامات على عدد سكانها قليل من الخلايا العصبية. وهذا، بدوره، تمكن من تحديد وتعقب من التشعبات والمحاور من الخلايا العصبية الفردية، والتوصيف الدقيق للموقع الصفحي من التوقعات محور عصبي، وتحليل المورفومترية. ويمكن أيضا IUE استخدامها لتحقيق التغييرات في استثارةالبرية من نوع (WT) أو الخلايا العصبية المعدلة وراثيا عن طريق الجمع بين ذلك مع تسجيل خلية كاملة من شرائح حادة من العقول electroporated. وتساهم هذه التقنيات اثنين إلى فهم أفضل للاقتران الربط الهيكلي والوظيفي والآليات الجزيئية التي تتحكم في التنوع العصبية خلال التنمية. هذه العمليات التنموية لها آثار مهمة على الأسلاك محور عصبي، والتنوع الوظيفي للخلايا العصبية، وعلم الأحياء من الاضطرابات المعرفية.
Introduction
تطوير الهياكل الشجرية ومحور عصبي هو أحد الجوانب الهامة من تنظيم الدائرة في الجهاز العصبي، بما في ذلك في القشرة الدماغية. انها تلعب دورا حاسما خلال الأسلاك انتقائيا من القطعان العصبية المختلفة. وأظهر عدد من التقارير الأخيرة أنه، بالإضافة إلى الاتصال، وينعكس التنوع الجزيئي للخلايا العصبية التي كتبها اقتناء وسائل محددة للغاية لإطلاق النار. ومع ذلك، فإن آليات تحديد استثارة والتواصل بين الأنواع الفرعية العصبية متميزة خلال التنمية، وكذلك درجة من التنسيق، لا تزال غير مفهومة 1 و 2.
في الجسم الحي loss- وكسب من وظيفة يحلل تسمح لدراسة العلاقة بين مستوى التعبير عن جينات محددة وتأثيرها في تطوير الدائرة. electroporation في الرحم (IUE) هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسةوظيفة الجين من الفائدة في السكان العصبية محددة ودراسة الأنماط العامة للاتصال بهم. ومع ذلك، لتحديد الخصائص المورفولوجية من المحاور والتشعبات في الطبقات القشرية في الفئران الحية، فمن الضروري لتسمية الخلايا العصبية قليلة. نظام إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية جنبا إلى جنب مع IUE يمكن استخدامها لوضع علامة على عدد قليل من السكان من الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لحل توقعات المنبعثة من الخلايا الفردية من laminas القشرية التي تم تحديدها. هذه الطريقة التسميات وجود عدد كاف من الخلايا العصبية في القشرة للحصول على البيانات الكمية بعد تحليل أرقام معقولة من العقول electroporated (الشكل 1). تقدم هذه المخطوطة طريقة لمثل هذا التحليل الدقيق للاتصال. كما يعرض استراتيجية مماثلة لتحليل، في تجارب منفصلة، والخصائص الكهربائية للخلايا العصبية عن طريق أداء التسجيلات المشبك الحالي على البروتين مضان أخضر (GFP) -electroporated الخلايا من شرائح القشرية الحادة. هذه المواليةtocols متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على دراسة استثارة والتواصل بين الخلايا العصبية من الحيوانات WT والمعدلة وراثيا، وأيضا من الخلايا العصبية التي يتم تقديمها الخسائر والمكاسب من وظيفة من البلازميدات إضافية خلال IUE.
على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف Electroporation للمن الفئران في يوم الجنينية (E) 15.5، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها في أي سن بين E9.5 3 ويوم ما بعد الولادة (P) 2 4. في حين Electroporation للفي المراحل المبكرة يستهدف الخلايا العصبية والسلائف من المهاد والطبقات العميقة من القشرة، علامات Electroporation للفي وقت لاحق في مرحلة طبقات أكثر سطحية (على سبيل المثال، الخلايا العصبية E15.5 IUE أهداف طبقة II-III). وباختصار، فإن الجمع بين IUE مع التحليل الصرفي وحيدة الخلية والكهربية هو أداة مفيدة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنوع الهيكلي والوظيفي الهائل من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تسمية الخلايا العصبية في القشرة الحسية الجسدية من C75BL / 6 الفئران من أجل تحليل الارتباط واستثارة بهم. وفيما يتعلق بأساليب القائمة، فإنه يتصور جوانب تميز من الاتصال، مثل عدد من فروع محور عصبي في الخلايا العصبية، والطوبوغرافيا على وجه …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لر غوتييريز وA. موراليس للحصول على مساعدة فنية ممتازة والى لوس انجليس فايس للتحرير. ويتم تمويل CGB من قبل الإسبان MINISTERIO دي Ciencia ه Innovación (MICINN)، FPI-بيز-2012-056011. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة BBVA وSAF2014-58598-جين (MINECO) لم. نافاريتي وبمنحة من مؤسسة Areces رامون والمنح SAF2014-52119-R وBFU2014-55738-REDT (من MINECO) ل م نييتو.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
