Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı
Summary
Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.
Abstract
Antikor yanıt somatik Hipermutasyon (SHM), sınıf-anahtarı DNA rekombinasyon (CSR) ve Plazma hücre farklılaşma da dahil olmak üzere birkaç kritik B hücre-içsel süreçleri gerçekleştirilir. Son yıllarda epigenetik değişiklikler veya faktörlere Histon deasetilasyonu ve mikroRNA (miRNAs), B hücreli genetik programlar şekil antikor yanıt,’epigenetik faktörler disfonksiyon neden tespit edilmiştir iken etkileşimde gösterilmiştir antikor yanıt. B hücreleri epigenetik modülatörler cevaben genom çapında miRNA ve mRNA ifade analiz B hücreli işlev ve antikor yanıtı epigenetik Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Burada, biz KSS ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi B hücreleri inducing, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri (HDIs) ile bu B hücreleri tedavi ve mRNA ve mikroRNA ifade analiz için bir protokol göstermek. Bu protokol için doğrudan yeni nesil mRNA sıralama (mRNA-seq) ve miRNA-seq teknolojileri, nasıl yapılacağını eşleme okur genom ve nicel ters transkripsiyon (qRT) kullanarak Tamamlayıcı DNA (cDNA) dizileri analiz-PCR. Bu yaklaşımlar ile CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi indüklenen B hücrelerde HDI, epigenetik bir regülatör, seçmeli olarak miRNA ve mRNA ifade modüle ve CSR ve Plazma hücre farklılaşması değiştirir, tanımladınız.
Introduction
Epigenetik işaretleri veya DNA metilasyonu, Histon ardından değişiklikler ve kodlamayan RNA’ların (mikroRNA’lar da dahil olmak üzere), gibi faktörler, hücre işlevi gen ifade1değiştirerek modüle. Epigenetik değişiklikler immünglobulin sınıf–düğme DNA rekombinasyon (CSR), somatik Hipermutasyon (SHM) ve bellek B hücreleri veya plazma hücreleri antikor ve antikor böylece oransal, farklılaşma gibi B lenfosit fonksiyon düzenleyen yanıt-e doğru2,3. CSR ve SHM eleştirel Etkinleştirme indüklenen sitidin birdeaminaz (yardım, Aicdakodlanmış), son derece B hücreleri T-bağımlı ve T-bağımsız antijenleri4yanıt indüklenen olduğu gerektirir. Sınıf-açık/hypermutated B hücreleri daha fazla 1 (Blimp1, Prdm1kodlanmış)5plazma hücrelerine antikorlar olgunlaşma B lenfosit kaynaklı protein eleştirel bağımlı bir biçimde büyük miktarda salgılar ayırt etmek. B hücreleri anormal epigenetik değişiklikleri Alerjik reaksiyon veya otoimmünite1,4yol açabilir anormal antikor/antikor yanıt neden olabilir. Nasıl epigenetik faktörleri anlama, miRNAs gibi B hücre içsel modüle gen ekspresyonu sadece aşı geliştirme için önemli değildir, ama aynı zamanda potansiyel anormal antikor/antikor yanıt mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Histon asetilasyon ve deasetilasyonu değişimleri genellikle Histon asetiltransferaz (şapka) ve Histon deacetylase (HDAC) tarafından katalize Histon proteinleri üzerinde lizin arasında vardır. Bu değişiklikler Kromatin artan veya azalan erişilebilirlik kurşun ve daha fazla izin vererek veya bağlama transkripsiyon faktörleri veya proteinler DNA ve tadilat gen ifade5,6, için 7 , 8. HDAC inhibitörleri (HDI) bir sınıf HDACs fonksiyonu ile müdahale bileşikleri vardır. Burada, HDI (VPA) iç gen ifade profil B hücreleri ve onun mekanizma HDAC Yönetmeliği gidermek için kullanılan.
miRNAs çeşitli aşamalarından oluşturulan küçük, kodlamayan RNA’ların yaklaşık 18-22 nükleotid uzunluğunda vardır. miRNA ana bilgisayar genlerin transkripsiyonu ve saç tokası birincil mikroRNA (PRI-miRNAs) oluşturur. Onlar nerede PRI-miRNAs daha da habercisi miRNAs (pre-miRNAs) işlenir sitoplazma, ihraç edilmektedir. Son olarak, olgun miRNAs pre-miRNAs bölünme meydana gelir. miRNAs onların hedef mRNA’ların6,7‘ nin 3’ Çevrilmeyen bölgesi içindeki tamamlayıcı dizileri tanıdım. Çoğu susturmak aracılığıyla miRNAs yayılması, farklılaşma ve Apoptozis10,11gibi hücresel aktivite düzenleyen. Birden fazla miRNAs aynı mRNA hedefleyebilir ve bir tek miRNA potansiyel olarak birden çok mRNA’ların hedefleyebilirsiniz beri miRNA ifade profil bireysel değerini ve miRNAs toplu etkisini anlamak için bir içerik görünümünü olması önemlidir. miRNAs B-hücre gelişimi ve periferik farklılaşma, hem de B hücreli sahne özgü farklılaşma, antikor yanıt ve otoimmünite1,4,9dahil olduğu gösterilmiştir. 3′ UTR’nin Aicda ve Prdm1, miRNAs8tarafından hedeflenen birkaç doğrulanmış veya tahmin edilen evrimsel korunmuş siteleri vardır.
Epigenetik modülasyon Histon sonrası transkripsiyon değişiklik ve miRNAs, dahil olmak üzere, hücre tipi ve hücre sahne özel düzenleme desen gen ifade9görüntüleyin. Burada, HDI aracılı modülasyon miRNA ve mRNA ifade, CSR ve Plazma hücre farklılaşması tanımlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bunlar B hücreleri CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi için ikna için protokol B hücreleri HDI ile tedavi etmek için; ve qRT-PCR, miRNA-seq ve mRNA seq10,11,12,8,13tarafından miRNA ve mRNA ifade analiz etmek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı B hücre sınıf anahtarlama ve Plazma hücre farklılaşması ikna etmek için kapsamlı yaklaşım sağlar; epigenetik modülatörler tarafından Yani HDI etkisini analiz etmek; ve bu hücreler HDI etkisini mRNA ve miRNA ifadesine algılamak için. Bu yaklaşımların çoğu insan B hücreli işlev ve mRNA/miRNA ifade epigenetik faktör etkisini analiz etmek için kullanılabilir. QRT-PCR ve mRNA-seq/miRNA-seq yaklaşımlar fareler gibi HDIs epigenetik modülatörler ile tedavi dan izole B hücrele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH hibe AI 105813 ve AI 079705 (PC için) tarafından desteklenen, Lupus araştırma hedef tanımlama Lupus Grant ALR 295955 (PC için) için İttifak ve artrit Ulusal Araştırma Vakfı araştırma (HZ) verin. TS desteklenen Pediatri Tıp Merkezi, ikinci Xiangya hastane, Merkezi Güney üniversite, Changsha, Çin, tarafından Xiangya-UT okul tıp San Antonio tıbbi öğrenci ziyaret programı bağlamında.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
