Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma
Summary
I fattori epigenetici possono interagire con programmi genetici di modulare l’espressione genica e regolare la funzione delle cellule B. Combinando la stimolazione in vitro delle cellule di B, qRT-PCR e microRNA-sequenza di alto-rendimento e sequenza di mRNA approcci, possiamo analizzare la modulazione epigenetica di miRNA e l’espressione genica in cellule di B.
Abstract
Risposte anticorpali sono compiute attraverso diversi processi critici intrinseco delle cellule B, tra cui hypermutation somatico (SHM), classe-interruttore ricombinazione del DNA (CSR) e la differenziazione delle cellule di plasma. Negli ultimi anni, delle modificazioni epigenetiche o fattori, quali la deacetilazione degli istoni e microRNA (Mirna), hanno dimostrati di interagire con programmi genetici delle cellule di B di risposte anticorpali di forma, mentre la disfunzione dei fattori epigenetici è stata trovata per portare a risposte degli autoanticorpi. L’analisi di espressione di miRNA e mRNA di genoma in cellule di B in risposta a modulatori epigenetici è importante per comprendere la regolazione epigenetica della risposta di funzione e dell’anticorpo di B-cell. Qui, dimostriamo un protocollo per indurre le cellule B per subire la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma, il trattamento di queste cellule di B con gli inibitori dell’istone deacetilasi (HDAC) (HDIs) e l’analisi di espressione di mRNA e microRNA. In questo protocollo, analizziamo direttamente sequenze complementari di DNA (cDNA) mediante sequenziamento di nuova generazione mRNA (mRNA-seq) e tecnologie di miRNA-seq, mappatura della sequenziazione legge al genoma e trascrizione d’inversione quantitativa (qRT)-PCR. Con questi approcci, abbiamo definito che, in cellule di B indotte per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma, HDI, un regolatore epigenetico, selettivamente modula l’espressione di mRNA e miRNA e altera la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma.
Introduction
Segni epigenetici o fattori, quali la metilazione del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni e RNA non codificanti (compresi i microRNA), modulano la funzione delle cellule alterando gene expression1. Modificazioni epigenetiche regolano la funzione dei linfociti B, come ricombinazione di immunoglobulina classe-interruttore del DNA (CSR), ipermutazione somatica (SHM) e differenziazione di cellule B memoria o le cellule di plasma, quindi modulando l’anticorpo e autoanticorpi le risposte2,3. CSR e SHM criticamente richiedono indotta da attivazione citidina deaminasi (aiuti, codificato come Aicda), che è altamente indotta in cellule di B in risposta a T-dipendente e di antigeni T-indipendenti4. Cellule di B di classe-acceso/hypermutated ulteriormente differenziano in cellule di plasma, che secernono grandi quantità di anticorpi in modo criticamente dipendente da proteina di maturazione dei linfociti B-indotta 1 (Blimp1, codificato come Prdm1)5. I cambiamenti epigenetici anormali in cellule di B possono provocare risposte aberranti anticorpo/autoanticorpi, che possono portare alla risposta allergica o autoimmunità1,4. Comprendere i fattori epigenetici come, ad esempio Mirna, modulano intrinseco delle cellule B espressione genica non è solo importante per lo sviluppo di vaccini, ma è anche essenziale per rivelare i meccanismi delle potenziali risposte anormali dell’anticorpo/autoanticorpi.
Deacetilazione e acetilazione dell’istone sono modifiche dei residui di lisina su proteine istoniche in genere catalizzate da istone acetiltransferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Queste modifiche portano all’accessibilità crescente o decrescente della cromatina e ulteriormente consentono o impediscono il legame di fattori di trascrizione o proteine a DNA e l’alterazione del gene espressione5,6, 7 , 8. gli inibitori HDAC (HDI) sono una classe di composti che interferiscono con la funzione di HDAC. Qui, abbiamo usato HDI (VPA) per affrontare il regolamento di HDAC sul profilo di espressione genica intrinseco delle cellule B e sul suo meccanismo.
Mirna sono piccole, non-codificazione RNAs circa 18 a 22 di nucleotidi di lunghezza generati attraverso diverse fasi. geni ospitanti miRNA sono trascritti e formano tornante microRNA primario (pri-miRNA). Sono esportati nel citoplasma, dove pri-miRNA sono ulteriormente trasformati in precursore Mirna (pre-miRNA). Infine, Mirna maturi si formano attraverso la scissione dei pre-miRNA. Mirna riconoscono le sequenze complementari all’interno della regione non tradotta 3′ della loro destinazione mRNAs6,7. Attraverso silenziamento post-trascrizionale, Mirna regolano l’attività cellulare, quali proliferazione, differenziamento e apoptosi10,11. Poiché più miRNA possono avere come bersaglio mRNA della stessa, e un singolo miRNA potenzialmente può avere come bersaglio mRNA multipli, è importante avere una vista nel contesto del profilo di espressione di miRNA a comprendere il valore dell’individuo e l’effetto collettivo di Mirna. i miRNA sono stati indicati per essere coinvolti in sviluppo della B-cellula e differenziazione periferica, così come B-differenziamento fase-specifici, risposta anticorpale e autoimmunità1,4,9. Nel 3′ UTR di Aicda e Prdm1, ci sono diversi siti previsti o convalidati evolutivamente conservati che possono essere la destinazione di Mirna8.
Modulazione epigenetica, tra cui modifica post-trascrizione dell’istone e Mirna, visualizzare un modello di regolamento fase-specifici delle cellule e cellula-tipo di gene espressione9. Qui, descriviamo i metodi per definire la modulazione HDI-mediata di miRNA ed espressione di mRNA, CSR e differenziazione delle cellule di plasma. Questi includono protocolli per indurre le cellule di B per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma; per il trattamento delle cellule di B con HDI; e per l’analisi di espressione di miRNA e mRNA da qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce gli approcci completi per indurre switching di classe B delle cellule e differenziazione delle cellule di plasma; per analizzare l’impatto di modulatori epigenetici, vale a dire HDI; e per rilevare l’effetto di HDI sull’espressione del mRNA e miRNA in queste cellule. La maggior parte di questi approcci è utilizzabile anche per analizzare l’impatto del fattore epigenetico sull’espressione di funzione e mRNA/miRNA B-cellula umana. Per analizzare le cellule B isolate da topi trattati con modulato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni AI 105813 e AI 079705 (per PC), l’Alleanza per l’identificazione di Target di ricerca Lupus in Lupus Grant ALR 295955 (per PC) e la ricerca di artrite National Research Foundation concedere (HZ). TS è stato sostenuto dal centro medico pediatria, secondo Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Cina, nell’ambito del programma di visita di studente di medicina Xiangya-UT School di medicina San Antonio.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
