Genomweite Analyse von HDAC-Inhibitor-vermittelten Modulation der Micro-RNAs und mRNAs in B Zellen induziert unterziehen Class-Schalter DNA-Rekombination und Plasma-Zell-Differenzierung
Summary
Epigenetische Faktoren können mit genetischen Programme zu modulieren Genexpression und regulieren die Funktion der B-Zellen interagieren. Durch die Kombination von in-vitro- B-Zell-Stimulation, qRT-PCR, und Hochdurchsatz-RNA-Sequenz und mRNA-Sequenz Ansätze, analysieren wir die epigenetische Modulation von MiRNA und gen-Expression in B-Zellen.
Abstract
Antikörperreaktionen werden durch mehrere wichtige B-Zell-inneren Prozesse, einschließlich somatische Hypermutation (SHM), Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und Plasma-Zell-Differenzierung durchgeführt. In den letzten Jahren epigenetische Modifikationen oder Faktoren wie Histon Deacetylation und Mikro-RNAs (MiRNAs), nachweislich mit B-Zelle genetische Programme zur Form Antikörperantworten interagieren, während die Dysfunktion des epigenetischen Faktoren gefunden wurde, um zu führen Autoantikörper Antworten. Genomweite MiRNA und mRNA Expression in B-Zellen als Reaktion auf epigenetischen Modulatoren Analyse ist wichtig für das Verständnis der epigenetischen Regulation der B-Zell-Funktion und Antikörper-Reaktion. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Induktion B-Zellen zu CSR und Plasmazelle Differenzierung zu unterziehen, behandeln diese B-Zellen mit Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren (HDIs) und Analyse von mRNA und MicroRNA Ausdruck. In diesem Protokoll analysieren wir direkt komplementäre DNA (cDNA) Sequenzen mit mRNA Sequenzierung der nächsten Generation (mRNA-Seq) und MiRNA-Seq Technologien, Zuordnung der Sequenzierung liest, das Genom und quantitative reverse Transkription (qRT)-PCR. Mit diesen Ansätzen haben wir festgelegt, dass in B-Zellen induziert CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu unterziehen, HDI, einen epigenetischen Regulator selektiv MiRNA und mRNA Ausdruck moduliert und CSR und Plasmazelle Differenzierung verändert.
Introduction
Epigenetischen Markierungen oder Faktoren, z. B. DNA-Methylierung und Histon posttranslationale Modifikationen nicht-kodierende RNAs (unter anderem Micro-RNAs) modulieren Zellfunktion durch Veränderung der gen-Expression-1. Epigenetische Modifikationen regulieren die Funktion von B-Lymphozyten, z. B. Immunglobulin Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und somatische Hypermutation (SHM) Differenzierung zu B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen, damit Modulation der Antikörper und Autoantikörper Antworten2,3. CSR und SHM erfordern kritisch Aktivierung-induzierte Cytidin Deaminase (AID, kodiert als Aicda), die hoch in B-Zellen als Reaktion auf T-abhängigen und T-unabhängige Antigene4induziert wird. Klasse-geschaltet/Hypermutated B-Zellen weiter differenzieren zu Plasmazellen, die große Mengen von Antikörpern in einer Art und Weise kritisch abhängig von B-Lymphozyten-induzierte Reifung Protein sezernieren 1 (Blimp1, als Prdm1codiert)5. Abnorme epigenetische Veränderungen in den B-Zellen führen aberranten Antikörper/Autoantikörper Antworten, was zu allergischen Reaktion oder Autoimmunität1,4führen kann. Verstehen, wie epigenetische Faktoren, wie z. B. MiRNAs, B-Zell-inneren modulieren Genexpression ist nicht nur wichtig für die Entwicklung von Impfstoffen, sondern ist auch wichtig, die Mechanismen der möglichen abnormalen Antikörper/Autoantikörper Antworten offenbaren.
Histon Acetylierung und Deacetylation sind Modifikationen der Lysin-Reste auf Histonproteine, die in der Regel durch Histon-Acetyltransferase (Hut) und Histon-Deacetylase (HDAC) katalysiert. Diese Änderungen führen zu zunehmender oder abnehmender Zugänglichkeit des Chromatins und weiter zulassen oder verhindern die Bindung von Transkriptionsfaktoren oder Proteinen, DNA und die Veränderung des Gens Ausdruck5,6, 7 , 8. HDAC-Inhibitoren (HDI) sind eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion der HDACs stören. Hier haben wir HDI (VPA) die Verordnung von HDAC auf die intrinsische Genexpressionsprofil von B-Zellen und ihr Mechanismus.
MiRNAs sind kleine, nicht-kodierende RNAs ca. 18 bis 22 Nukleotide in der Länge, die in mehreren Phasen generiert werden. MiRNA Host Gene transkribiert werden und bilden Haarnadel primäre Micro-RNAs (Pri-MiRNAs). Sie werden in den Zytoplasma exportiert wo Pri-MiRNAs in Vorläufer MiRNAs (Pre-MiRNAs) weiterverarbeitet werden. Schließlich sind Reifen MiRNAs durch die Spaltung von Pre-MiRNAs gebildet. MiRNAs erkennen die komplementäre Sequenzen innerhalb der 3′ untranslatierten Region ihre Ziel mRNAs6,7. Durch posttranskriptionelle zum Schweigen zu bringen, regulieren MiRNAs zelluläre Aktivität, wie z. B. Proliferation, Differenzierung und Apoptose10,11. Da mehrere MiRNAs die gleichen mRNA gezielt können und einem einzigen MiRNA kann potenziell mehrere mRNAs Ziel, ist es wichtig, eine im Kontext der MiRNA-Expressionsprofil zu verstehen, den Wert des einzelnen und die gemeinsame Wirkung von MiRNAs blicken. MiRNAs haben gezeigt, dass B-Zellentwicklung und peripheren Differenzierung als auch B-Zell-Stadium-spezifische Differenzierung, Antikörper-Reaktion und Autoimmunität1,4,9beteiligt werden. In der 3′ UTR Aicda und Prdm1gibt es mehrere validierte oder vorhergesagten evolutionär konservierte Websites, die von MiRNAs8ausgerichtet werden können.
Epigenetische Modulation, einschließlich Histon Post-Transkription Modifikation und MiRNAs, eine Zelltyp und Zelle Stadium-spezifische Verordnung Muster gen Ausdruck9anzeigen Hier beschreiben wir Methoden um die HDI-vermittelten Modulation der MiRNA und mRNA Ausdruck, CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu definieren. Dazu gehören Protokolle zur Induktion B-Zellen zu CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu unterziehen; für die Behandlung von B-Zellen mit HDI; und für die Analyse von MiRNA und mRNA Expression von qRT-PCR, MiRNA-Seq und mRNA-Seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet umfassende Ansätze zur B-Zelle Klasse wechseln und Plasma-Zell-Differenzierung zu induzieren; Ihre Auswirkungen durch epigenetische Modulatoren, nämlich HDI zu analysieren; und die Wirkung von HDI auf mRNA und MiRNA Ausdruck in diesen Zellen zu erkennen. Die meisten dieser Ansätze können auch verwendet werden, um die Auswirkungen der epigenetischen Faktor auf menschlichen B-Zell-Funktion und mRNA/MiRNA Ausdruck zu analysieren. Die qRT-PCR und mRNA-Seq/MiRNA-Seq Ansätze können auch verwendet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit von NIH-Stipendien AI 105813 und AI 079705 (auf PC) unterstützt wurde, gewähren die Allianz für Lupus Forschung Zielkennzeichnung in Lupus Grant ALR 295955 (auf PC) und der National Research Foundation Arthritis-Forschung (HZ). TS wurde unterstützt von Kinderheilkunde Medical Center, zweite Xiangya Krankenhaus, Central South University Changsha, China, im Rahmen des Programms Xiangya-UT Schule von Medizin San Antonio Medizinstudent besuchen.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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