Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек
Summary
Мы представляем метод выделения и культуры мыши Вольфианская канала (WD). Мы также продемонстрировать подробную процедуру для всей горы иммунным культивируемых / свежеизолированных WDs с флуоресцентно мечеными антителами. Вместе эти методы позволяют исследование развития WD, скручивании и дифференциации.
Abstract
Трубное морфогенез является фундаментальным требованием для развития большинства органов млекопитающих, в том числе мужской репродуктивной системы. Придатка, неотъемлемая часть мужского репродуктивного тракта, отвечает за хранение спермы, созревания и транспорта. Взрослый придатка является очень гибкой трубкой, которая развивается от простого и прямого эмбрионального предшественника, известного как Вольфианская канала (WD). Правильная намотка придатка имеет важное значение для мужской фертильности, так как сперма в яичках не могут оплодотворить яйцеклетку. Тем не менее, механизм, ответственный за развитие придатка и скручивании остается неясным, частично из-за отсутствия всей культуры органов и визуализации методов. В данном исследовании мы опишем систему в пробирке культуру и весь протокол иммунофлюоресценции монтирования лучше визуализировать процесс WD навивки и развития, которые также могут быть применены для изучения других трубчатых органов.
Introduction
Мужской репродуктивной системы, прежде всего, состоит из семенников, сайт для развития зародышевых клеток и дифференцировки, а также сложной системы протоковой, которая требуется для созревания, транспортировки и хранения спермы. Придатка представляет собой трубчатый орган , который соединяет яичко с семяпровода и в основном участвуют в пост-тестикулярной развития и созревания половых клеток 1. Высоко свернутых придатки взрослых мышей развивается от простого и прямого предшественника трубы, Вольфианская канала (WD) 1. Сложная и обмотанный структура придатка имеет важное значение для спермы , чтобы приобрести способность к оплодотворению женских половых клеток 2. Как такой важный орган для мужской фертильности развивается и получает в форме не очень хорошо понял. Различные сигнальные пути , как было показано, участвуют в развитии WD , таких как сигнального пути Wnt 3,4 и андрогена пути 5 сигнализации. Наша недавняя работа установила требование БАЛсский Wnt сигнализации для WD навивки во время внутриутробного развития 4. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять механизмы, участвующие в послеродовом придатка навивки, клеточной дифференцировки, а также от клетки к клетке связи внутри придатка эпителия и интерстициальных клеток.
Генетически модифицированные мышиные модели были доказаны , чтобы быть мощным инструментом для идентификации / проверки молекулярных механизмов , лежащих в основе развития и заболевания различных органов и систем 6. Несмотря на широкое использование, существуют значительные ограничения генетически модифицированных моделей мышей, в том числе непредсказуемого фенотипа целевых мутантов мыши с относительно предполагаемой функции гена, и не фенотипа у нулевых мутантов в некоторых моделях, влияние генетических и экологических факторов, трудоемкие и трудоемкий процесс разработки моделей мыши. Таким образом, интерпретация значимости полученных результатов только с использованием генетически модифицированныйспециалисты – мышиные модели не всегда просто 6. Эти ограничения могут быть преодолены путем использования в системе культуры пробирке орган , который дает нам возможность манипулировать несколько сигнальных путей в режиме реального времени в контролируемых условиях культивирования. Система органной культуры играет важную роль в понимании физиологии и патологии целых органов 7. Кроме того, визуализация целых органов , окрашенных с флуорофором меченых антител позволяет визуализировать маркеры , представляющие интерес в трехмерном контексте, как она существует в естественных условиях, обеспечивая тем самым лучшее понимание формы этого органа, структуры и функции 8.
Здесь мы описали методы для выделения мышиных эмбриональных гонад гребней, культуры в пробирке и всей горе иммунофлюоресценции визуализации WDs, которые могут быть применены , чтобы ответить на различные вопросы , касающиеся морфогенеза трубчатых органов , таких как WDs. В этом протоколе, мыизолированных мышиных эмбриональных урогенитальные гребни с 15,5 дней после коитуса (DPC) беременных дамб и культивировали их в течение 3 дней с последующим иммунным для эпителиального клеточного маркера (цитокератин 8, CK8), маркера пролиферации клеток (фосфо-гистона 3, PH3) и активным βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Система культуры орган имеет много преимуществ по сравнению с традиционной системой клеточной культуры. Эта система сохраняет первоначальные структурные отношения и взаимодействия между различными типами клеток. Он имитирует в естественных условиях систем и дает более точную ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов группы онкологической гинекологии для критического чтения этой рукописи. Эта работа частично поддержана финансирование из Медицинского исследовательского совета Научно-исследовательского совета Австралийского национального здравоохранения и, и онкологического института NSW (PST). МК является получателем университета Ньюкасла постдипломного проведение исследовательских работ.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
