Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Neuroanatomía es uno de los fundamentos de la neurociencia ¹ y el interés reciente en "conectómica" ha renovado el entusiasmo para la comprensión de la diversidad morfológica de poblaciones neuronales y las conexiones entre las neuronas específicas ^2. Los métodos para el etiquetado y la reconstrucción de las neuronas han mejorado en gran medida con las innovaciones recientes, incluyendo el trazado de circuito y genética mediada por virus enfoques ^{3, 4,} lo que permite estudios morfológicos más amplios de poblaciones neuronales ^5. Además de las mejoras en el etiquetado de las neuronas individuales, técnicas de análisis de datos cuantitativos también han surgido que permiten la clasificación independiente e imparcial de las neuronas en distintas subpoblaciones en base a los datos morfológicos ^{5, 6.} Estas técnicas son imparciales una mejora sobre más TRADICIONAl métodos cualitativos de clasificación que han sido la norma en el campo durante más de un siglo. El objetivo de este estudio es describir, paso a paso, la combinación de etiquetado mediada por virus de las neuronas dentro de una población selectiva, reconstrucciones a gran escala de una muestra amplia de estas neuronas, y el análisis de datos cuantitativos basados ​​en la agrupación independiente evaluación estadística. Mediante la combinación de estos métodos, se describe un nuevo enfoque hacia la recopilación y el análisis de los datos neuroanatómicos para facilitar la toma de muestras completa y una clasificación no sesgada de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva.

Como ejemplo de estos métodos, se describe el análisis de una gran población de neuronas dentro de un solo sector del núcleo reticular talámico (TRN) del mono macaco. Estos datos son de un estudio previo ^7. Métodos para marcar selectivamente las neuronas TRN que se proyectan hacia el latera dorsall geniculado núcleo del tálamo (dLGN) mediante inyección quirúrgica del virus de la rabia modificado que codifica la EGFP ^{4, 8} (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 2) se describen. Este virus de la rabia modificada carece del gen que codifica una proteína de la cubierta esencial, la eliminación de movimiento trans-sináptica del virus. Una vez que el virus entra en terminales de los axones en el sitio de inyección, que actúa como un trazador retrógrado tradicional con la ventaja importante de dirigir la expresión de EGFP en toda la arborización dendrítica completa de las neuronas infectadas ^{5, 9, 10.} Por consiguiente, este virus de la rabia eliminado G-puede ser utilizado para infectar y etiquetar cualquier población neuronal después de la inyección y transporte retrógrado selectivamente.

Con el fin de realizar un análisis exhaustivo de una población neuronal específica, es importante tomar muestras deuna amplia distribución de las neuronas dentro de la población. Debido a que la técnica de etiquetado mediada por virus produce intracelular completa, "Golgi-like" llena de muchas neuronas con axones en el sitio de la inyección del virus, es posible reconstruir una muestra muy grande de las neuronas dentro de la extensión completa de una estructura cerebral. Además, debido a que el virus de la rabia modificado es tan eficaz en infectar y etiquetado de un gran número de neuronas, es posible reconstruir cientos de neuronas por animal. Los procedimientos para el muestreo de 160 neuronas en todo el sector visual de la TRN ¹¹ con el fin de generar una muestra completa de dLGN proyectan neuronas TRN se describen. Se describe el proceso de reconstrucción de las neuronas individuales utilizando un sistema de reconstrucción de las neuronas incluyendo un microscopio, cámara y software de reconstrucción. También se describen métodos para determinar las posiciones de las neuronas individuales dentro de una estructura del cerebro (en este caso dentro de la TRN) y para verificar el virus de la inyección sitel volumen de correo y la ubicación dentro de una estructura (en este caso dentro de la dLGN) usando reconstrucciones volumétricas de contorno. Pasos para exportar los datos morfológicos y realizar agrupación independiente de análisis basados ​​en métricas se describen morfológicos medidos para cada neurona. Existen limitaciones en los métodos de agrupamiento y también hay una variedad de diferentes algoritmos de agrupación disponibles. En consecuencia, se describen estas opciones y las ventajas de algunos de los algoritmos más comúnmente utilizados. El análisis de conglomerados no proporciona una verificación estadística de la singularidad de las agrupaciones. Por lo tanto, los pasos adicionales se describen para verificar la agrupación óptima, así como las relaciones entre los datos morfológicos dentro ya través de las agrupaciones. Métodos estadísticos para evaluar las agrupaciones para el conjunto de datos TRN para confirmar que las neuronas TRN se agrupan en tres grupos únicas basadas en 10 mediciones morfológicas independientes están descritas.

Por lo tanto, delineando los pasos para el etiquetado de forma selectiva, La reconstrucción, y el análisis de datos morfológicos de una población neuronal específica, se describen los métodos para la cuantificación de las diferencias morfológicas entre las neuronas dentro de una población. hallazgos previos de tipos neuronales distintas dentro del sector de la visual de la TRN mono macaco se confirman con métodos distintos de evaluación estadística. Juntos, esperamos que estas técnicas serán ampliamente aplicable a conjuntos de datos neuroanatómicos y ayudar a establecer la clasificación cuantitativa de la diversidad de las poblaciones neuronales a través del cerebro.