Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Neuroanatomia é um dos fundamentos da neurociência ¹ e interesse recente no "conectonomia" renovou o entusiasmo para a compreensão da diversidade morfológica de populações neuronais e as conexões entre os neurônios específicos ^2. Métodos para a rotulagem e neurônios reconstruindo melhoraram muito com as recentes inovações, incluindo o rastreamento circuito genético e mediada por vírus aproxima ^{3, 4,} permitindo pesquisas morfológicas mais abrangentes de populações neuronais ^5. Além de melhorias na rotulagem neurônios individuais, técnicas de análise de dados quantitativos também surgiram que permitem a classificação independente e imparcial de neurônios em subpopulações distintas com base em dados morfológicos ^{5, 6.} Estas técnicas imparciais são uma melhoria em cima mais traditional métodos de classificação qualitativos que têm sido o padrão no campo por mais de um século. O objetivo deste estudo é delinear, passo-a-passo, a combinação de rotulagem mediada por vírus de neurônios dentro de uma população seletiva, reconstruções em larga escala de uma amostra abrangente desses neurônios, e análise quantitativa dos dados baseados em agrupamento independente com avaliação estatística. Ao combinar esses métodos, destacamos uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos para facilitar a amostragem completa e classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicas dentro de uma população neuronal selectiva.

Como um exemplo destes métodos, que descrevem a análise de uma grande população de neurónios dentro de um único sector de o núcleo reticular talâmico (TRN) do macaco macaque. Estes dados são de um estudo prévio ^7. Métodos para marcar seletivamente neurônios TRN salientes ao latera dorsall geniculate núcleo do tálamo (dLGN) usando a injeção cirúrgica do vírus da raiva modificado que codifica EGFP ^{4, 8} (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 2) são delineadas. Este vírus da raiva modificada não tem o gene que codifica para uma proteína de revestimento essencial, eliminando o movimento trans-sináptica do vírus. Uma vez que o virus entra terminais de axónios no local da injecção, ela age como um traçador retrógrado tradicional com a importante vantagem de dirigir a expressão de EGFP em toda a arborização dendrítica completa de neurónios infectados ^{5, 9, 10.} Por conseguinte, este vírus da raiva suprimida-G pode ser utilizada para infectar selectivamente e rotular qualquer população de neurónios a seguir à injecção e transporte retrógrado.

Para realizar uma análise global de uma população neuronal específica, é importante para provar a partir deuma ampla distribuição dos neurónios dentro da população. Uma vez que a técnica de marcação mediada por vírus produz intracelular completo ", de Golgi-like" enche de muitos neurónios com axónios no local da injecção do vírus, é possível reconstituir uma amostra muito grande dos neurónios dentro de toda a extensão de uma estrutura do cérebro. Além disso, porque o vírus da raiva modificado é tão eficaz em infectar e rotulagem de grandes números de neurónios, é possível reconstruir centenas de neurónios por animal. Os procedimentos de amostragem 160 neurónios em todo o sector visual da TRN ^11, a fim de gerar uma amostra global de dLGN-se projectam neurónios TRN são descritas. O processo de reconstrução neurônios individuais usando um sistema de reconstrução neurônio incluindo um microscópio, câmera e software de reconstrução é descrito. Também são descritos métodos para determinar as posições de neurônios individuais dentro de uma estrutura cerebral (neste caso dentro da TRN) e verificar vírus injecção site volume e localização dentro de uma estrutura (neste caso, dentro do dLGN) usando reconstruções contorno volumétricos. Etapas para exportar dados morfológicos e executar agrupamento independente análises com base em métricas morfológicas medidos para cada neurônio são delineadas. Existem limitações para métodos de agrupamento e também há uma variedade de diferentes algoritmos de agrupamento disponíveis. Assim, estas opções e os benefícios de alguns dos algoritmos mais comumente utilizados são descritos. A análise de cluster não fornece verificação estatística da singularidade de clusters. Por conseguinte, os passos adicionais são descritos para verificar agrupamento óptima, bem como as relações entre os dados morfológicos dentro e entre grupos. métodos estatísticos para avaliar os clusters para o conjunto de dados de TRN para confirmar que os neurônios TRN são agrupados em três grupos exclusivos com base em 10 métricas morfológicas independentes são descritos.

Assim, por delinear passos para a rotulagem selectiva, Reconstruir, e análise de dados morfológicos a partir de uma população neuronal específica, que descrevem métodos para quantificar diferenças morfológicas entre os neurónios dentro de uma população. achados anteriores de tipos neuronais distintas dentro do setor visual da TRN macaco macaque são confirmadas com métodos distintos de avaliação estatística. Juntos, esperamos que estas técnicas serão amplamente aplicável a conjuntos de dados neuroanatômicos e ajudar a estabelecer a classificação quantitativa da diversidade de populações neuronais através do cérebro.