Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
rilevazione accurata identificazione di mutazioni a bassa frequenza possono essere problematico nel valutare malattia residua dopo la terapia, screening per mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia, o quando i pazienti hanno poche cellule tumorali circolanti. Wild-type blocco PCR seguita da analisi di sequenziamento offre alta sensibilità, flessibilità e semplicità come una metodologia per individuare queste mutazioni a bassa frequenza. Con l'aggiunta di un costume disegnato bloccato oligonucleotide acido nucleico ad una nuova o precedentemente stabilito saggio di sequenziamento PCR convenzionale, sensibilità di circa 1 allele mutante in un fondo di 1.000 alleli WT possono essere raggiunti (1: 1.000). artefatti sequenziamento associati ad eventi deaminazione trovano comunemente nei tessuti paraffina fissate in formalina può essere parzialmente ovviato dall'utilizzo di uracile glicosilasi DNA durante fasi di estrazione. Il protocollo ottimizzato qui è specifico per la rilevazione MYD88 mutazione, ma può servire come modello per la progettazione di qualsiasisaggio di WTB-PCR. Vantaggi del test WTB-PCR su altri saggi comunemente utilizzati per la rivelazione di mutazioni a bassa frequenza incluse allele specifico PCR e real-time PCR quantitativa comprendono meno occorrenze di falsi positivi, una maggiore flessibilità e facilità di implementazione, e la capacità di rilevare sia noto e mutazioni sconosciute.
Sanger sequenziamento è stato tradizionalmente il gold standard in fase di test per entrambi noti e sconosciuti mutazioni somatiche. Uno dei limiti di sequenziamento Sanger è il suo limite di rilevabilità (~ 10 – 20% allele mutante in un contesto di WT) 1. Questo livello di sensibilità è appropriato per rivelare mutazioni somatiche basso livello che possono essere presenti nei campioni di tessuti precancerose o pazienti con poche cellule tumorali circolanti, o quando midollo osseo (BM) è irregolare. Questo rende anche valutare malattia residua dopo la terapia o la rilevazione di mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia difficile mediante sequenziamento convenzionale solo 2. Sostituendo PCR convenzionale con acido nucleico bloccato (LNA) mediata wild-type blocco PCR (WTB-PCR) in Sanger sequenziamento, sensibilità fino allo 0,1% allele mutante in uno sfondo di WT può essere raggiunto 2, 3, 4. InWTB-PCR, arricchimento per alleli mutanti è ottenuta tramite l'aggiunta di una breve (~ 10 – 14 NT) blocco (LNA) oligonucleotide che si lega preferenzialmente WT DNA impedendo così l'amplificazione del DNA WT. Il prodotto WTB-PCR arricchito mutante può quindi essere sequenziato. Bloccando WT DNA piuttosto che selezionare per mutazioni specifiche WTB-PCR permette l'arricchimento di entrambe le mutazioni conosciute e non presenti nelle frazioni cellulari minute.
Più metodi attualmente utilizzati per la rilevazione di mutazioni in piccole celle frazioni. Questo include PCR, amplificazione refrattaria sistema allele-specifica mutazione (ARMS), denaturazione cromatografia liquida ad alta prestazione (DHPLC), perline, emulsioni, amplificazione, e magnetismo (raggiante), rilascio indotta dal campo elettrico e misura (Efirm), alta risoluzione punto di fusione e altri. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono limitati dai falsi positivi e la capacità di rilevare solo una mutazione che il test è stato progettato per 4 </sup>. WTB-PCR, tuttavia, consente all'utente di visualizzare tracce di sequenziamento che consente il rilevamento di diversi tipi di mutazione e può aiutare a escludere falsi positivi dovuti ad artefatti o eventi deaminazione. sequenziamento di prossima generazione (NGS) può offrire una valida alternativa al sequenziamento convenzionale, tuttavia, sostanzialmente maggiori costi, complessità e tempo saggio più rendono un'opzione inutile per molti tipi di malattie con poche marcatori molecolari distinti o per il monitoraggio di pazienti in terapia per emergenti mutazioni di resistenza. Inoltre, elevati tassi di falsi positivi al rilevamento varianti con frequenze alleliche mutanti inferiori al 5% possono rappresentare un problema per NGS ampliconi basati 5, 6.
Qui mostriamo l'aumento della sensibilità raggiunto da WTB-PCR in screening per mutazioni nel differenziamento mieloide fattore di 88 geni come descritto da Albitar et al. 3 MYD88 mutations sono importanti fattori diagnostici e prognostici in Macroglobulinemia di Waldenström (WM), IgM gammopatia monoclonale di significato sconosciuto (IgM MGUS), della milza linfoma della zona marginale (SMZL), e linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL). mutazioni MYD88 si trovano in quasi tutti i casi di WM e circa il 50% dei pazienti con immunoglobuline M (IgM) -secernenti MGUS. Contrastingly, mutazioni MyD88 si trovano solo 0-6% dei pazienti con SMZL e sono assenti nel mieloma multiplo 7, 8. Poiché morfologica sovrapposte, immunofenotipica, citogenetica, e caratteristiche cliniche tra WM e SMZL o mieloma multiplo IgM spesso può complicare diagnosi differenziale, la presenza di una mutazione MYD88 può servire come un fattore che identifica utile 9. Mutazioni MYD88 sono stati associati con una maggiore carico di malattia nei pazienti con DLBCL e la scarsa sopravvivenza globale dopo la terapia 7, </sup> 10. Inoltre, poiché le mutazioni MYD88 sono più frequentemente trovati in attivo (ABC) DLBCL B-cell-like di centro germinale B-cell-like (GCB) DLBCL o linfoma primario del mediastino cellule B (PMBL), MYD88 stato mutazionale può servire come marker surrogato per il sottotipo ABC 11, 12.
Il protocollo dettagliato qui fornito serve come modello da cui nuovi saggi possono essere sviluppati o maggior saggi sequenziamento esistenti possono essere facilmente adattati per rilevare accuratamente mutazioni a bassa frequenza in vari tipi di campioni. L'approccio può essere utilizzato anche per monitorare e rilevare mutazioni resistenti che possono svilupparsi nei tumori o anche batteri che possono svilupparsi mentre i pazienti sono stati trattati con la terapia mirata o antibiotici. Inoltre, si rivolge e rimedi molti dei problemi connessi con l'arricchimento di mutazione, in particolare nel tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE).
Il saggio WTB-PCR qui descritto utilizza una serie generica di primer con un oligo blocco progettato per bloccare l'amplificazione di DNA WT durante l'estensione (Figura 1). Il prodotto di WTB-PCR viene quindi sequenziato per l'analisi mutazionale. L'utilità di WTB-PCR / Sanger risiede nella sua semplicità, ad alta sensibilità e alta produttività. Utilizzando le indicazioni descritte qui, la maggior parte dei saggi basati Sanger esistenti possono essere facilmente modificati tramite …
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
Slide basket | |||
Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
Wash reservoir | ~1000 ml | ||
Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |