כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
בתגובה מסתגלת היא חיונית להישרדות חיידקים. כדי לזהות ולהגיב לשינויים סביבתיים, חיידקים להשתמש במערכת גירוי תגובה המכונית איתות דו רכיבים. 1,2 במערכת דו רכיבים טיפוסית, קינאז היסטידין מזהה גירוי מאותו מקור, autophosphorylates שאריות היסטידין המשומר שלה, ואז מעביר פוספט שאריות aspartate משומרות על תחום המקלט של חלבון רגולטור תגובה. 3 אירוע זה מעורר שינוי בפעילות של הרגולטור בתגובה, אשר מגרה השפעה במורד הזרם. 4,5 לכן, חיידקים מסוגלים לחוש להסתגל לשינויים בסביבה המקומית. כמה מערכות אזעקה דו רכיבים לסטות ארכיטיפ זה. במקרים מסוימים, התחום החושי של קינאז היסטידין הוא חלבון עצמאי, אשר ישירות מזהה את הקלט החושי ומשנת פעילות קינאז באמצעות אינטראקציה בין חלבונים. 6 – 8 עם זאת, הקרןתהליך amental ואת התפקיד כולל של המערכת נשאר זהה. איתות דו מרכיבים היא מערכת גירוי-תגובה בכל מקום כי הוא חיוני להישרדות חיידקים, קינאזות היסטידין לשחק תפקיד קריטי התמרה של האות. 9
למרות חשיבותו של קינאזות היסטידין לביולוגיה בקטריאלי, הם נשארים גרועים מאופיינים. זאת בשל חוסר היציבות הטבוע phosphohistidine, וחוסר שיטה מעשית למדידת autophosphorylation. Phosphohistidine הוא יותר יציב מאשר phosphoserine, phosphothreonine, ו phosphotyrosine. 10 לפיכך, טכניקות שאינן בשימוש נפוץ לנתח שירו / Thr / קינאזות Tyr אינן ישימות עבור קינאזות היסטידין. 11 מבחני חוץ גופית ללמוד קינאזות היסטידין כבר מוגבלת בעיקר autoradiography SDS-PAGE. 12,13 בשיטה זו, -ATP [32 P γ-] הוא מודגרות עם קינאז, ו זרחון של קינאז מנותח על ידי polג'ל אלקטרופורזה yacrylamide (עמוד) ואחריו autoradiography של הג'ל. שיטה זו יכולה לשמש כדי לפקח autophosphorylation קינאז, וכן phosphotransfer מן קינאז לווסת תגובה. עם זאת, בשיטה זו יש חסרונות בולטים. מבחנים מבוססי עמוד הם תפוקה נמוכה זמן רב. מגבלות אלו הן לא תורמים לאפיון חלבון ולוודא פרמטרים הקינטית שלו. שיטה חלופית ללימוד קינאזות היסטידין שפורסם לאחרונה מנצל נוגדנים phosphohistidine לזהות autophosphorylation. 14 אמנם שיטה זו יש את היתרון של הבחנה בין 1-phosphohistidine ו -3-phosphohistidine, תלויים במכשור לצורך האיתור, שיטה זו עשויה שלא להציע טווח דינמי גדול או גבול עליון גבוה לגילוי. לפיכך, יש צורך assay מהיר, פחות מייגע, ורגיש יותר, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד חלבונים חשובים אלה.
כאן אנו מתארים ו דemonstrate assay מחייב nitrocellulose פותחו בקפידה, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת autophosphorylation של קינאזות היסטידין חיידקי מטוהרים במבחנה. assay זה תפוקה גבוהה יותר ונדרש זמן רב פחות מבוסס מבחני עמוד. השיטה גם מנצלת קרינת צ'רנקוב כימות phosphohistidine, המציעה גבול עליון גבוה של איתור טווח דינמי גדול. Assay יכול לשמש כדי לקבוע פרמטרים קינטיים קינאזות היסטידין.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nitrocellulose מחייב assay שתיארנו יש יתרונות רבים על פני שיטות השתמשו בעבר כדי לאפיין קינאזות היסטידין. בהשוואת autoradiography SDS / עמוד מבוסס מסורתי, השיטה שלנו היא תפוקה גבוהה יותר ופחות זמן רב. קרום nitrocellulose הוא יותר קל לטפל מאשר ג'ל SDS, ואינו צריך להיות קבוע. Ponceau מכתים את nitrocellulose …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך באמצעות סיוע בוגר תחומי תכנית צורך הלאומי (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
References
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
