Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure

réponse adaptative est cruciale pour la survie des bactéries. Afin de détecter et de réagir aux changements environnementaux, les bactéries utilisent un système stimulus-réponse connue sous le nom de signalisation à deux composants. ^1,2 Dans un système à deux composants typique, l'histidine kinase détecte un stimulus apparenté, autophosphoryle son résidu d'histidine conservé, puis transfère le phosphate à un résidu aspartate conservé sur le domaine de récepteur d'une protéine régulatrice de la réponse. ³ Cet événement déclenche un changement dans l'activité du régulateur de réponse, ce qui stimule un effet en aval. ^4,5 Ainsi, les bactéries sont capables de détecter et d' adaptation aux changements dans l'environnement local. Certains systèmes de signalisation à deux composants dévient de cet archétype. Dans certains cas, le domaine sensorielle de l'histidine kinase est une protéine autonome qui détecte directement l'entrée sensorielle et modifie l'activité de la kinase par l'intermédiaire d'une interaction protéine-protéine. ^6-8 Toutefois, le fondsprocessus amental et le rôle global du système reste le même. signalisation à deux composants est un système de stimulus-réponse ubiquitaire qui est essentielle pour la survie des bactéries et histidine kinases jouent un rôle critique dans la transduction du signal. ⁹

Malgré l'importance des histidine kinases à la biologie bactérienne, ils restent mal caractérisés. Ceci est dû à l'instabilité inhérente de phosphohistidine, et l'absence d'une méthode pratique pour la mesure de l'autophosphorylation. Phosphohistidine est plus labile que la phosphosérine, la phosphothréonine et la phosphotyrosine. ¹⁰ Ainsi, les techniques qui sont couramment utilisés pour analyser kinases Ser / Thr / Tyr ne sont pas applicables pour les kinases histidine. ¹¹ essais in vitro pour étudier histidine kinases ont été largement limitée à SDS-PAGE autoradiographie. ^12,13 Dans ce procédé, [γ- ³² P] -ATP est mis en incubation avec la kinase et la phosphorylation de la kinase est analysée par Polélectrophorèse sur gel de yacrylamide (PAGE) suivie par une autoradiographie du gel. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller l'autophosphorylation de kinase, ainsi que phosphotransfert de la kinase à un régulateur de réponse. Cependant, cette méthode présente des inconvénients notables. des analyses basées sur PAGE-sont bas débit et de temps. Ces limitations ne sont pas propices à la caractérisation d'une protéine et déterminer ses paramètres cinétiques. Une méthode alternative pour l'étude des histidine kinases qui a été publié récemment, utilise des anticorps pour détecter phosphohistidine autophosphorylation. ¹⁴ Bien que cette méthode a l'avantage de distinguer entre 1-phosphohistidine et 3-phosphohistidine, en fonction de l'instrumentation utilisée pour la détection, cette méthode ne peut pas offrir une large gamme dynamique ou limite supérieure de détection élevé. Ainsi, il existe un besoin pour un test plus rapide, moins pénible et plus sensibles qui peuvent être utilisés pour étudier ces protéines importantes.

Ici, nous décrivons et demonstrate soigneusement mis au point un essai de nitrocellulose de liaison qui peut être utilisé pour quantifier autophosphorylation de kinase histidine bactérienne purifiée in vitro. Ce test est un débit plus élevé et moins de temps que des analyses basées sur PAGE. Le procédé utilise également Cherenkov rayonnement pour phosphohistidine quantification, qui offre une limite supérieure de détection élevée et une grande plage dynamique. Le dosage peut être utilisé pour déterminer les paramètres cinétiques pour histidine kinases.