الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
استجابة تكيفية حاسمة لبقاء البكتيريا. من أجل كشف والاستجابة للتغيرات البيئية والبكتيريا استخدام نظام الحوافز والاستجابة المعروفة باسم إشارات مكون اثنين. 1،2 في نظام ثنائي مكون نموذجي، كيناز الحامض الاميني يكشف حافز وما شابه ذلك، autophosphorylates بقايا لها الحامض الاميني الحفظ، ثم ينقل الفوسفات إلى بقايا اسبارتاتي الحفظ على نطاق الاستقبال من البروتين استجابة منظم. 3 هذا الحدث يؤدي إلى تغيير في نشاط منظم استجابة، مما يحفز تأثير المصب. 4،5 وهكذا، البكتيريا قادرة على الإحساس والتكيف مع التغيرات في البيئة المحلية. بعض أنظمة إنذار مكون اثنين تحيد عن هذا النموذج الأصلي. في بعض الحالات، المجال الحسي للكيناز الحامض الاميني هو بروتين قائمة بذاتها، الذي يكتشف مباشرة المدخلات الحسية ويعدل النشاط كيناز من خلال تفاعل البروتين البروتين. 6-8 ومع ذلك، فإن صندوقعملية amental ودورها الشامل للنظام لا يزال هو نفسه. إشارات ثنائي مكون هو نظام الحوافز والاستجابة في كل مكان التي لا غنى عنها لبقاء البكتيريا، وتحركات الحامض الاميني تلعب دورا حاسما في تنبيغ الإشارة. 9
وعلى الرغم من أهمية تحركات الحامض الاميني لعلم الأحياء البكتيرية، إلا أنها تظل سيئة تتسم. ويرجع ذلك إلى عدم الاستقرار المتأصل في phosphohistidine، وعدم وجود طريقة عملية لقياس autophosphorylation هذا. Phosphohistidine أكثر عطوب من phosphoserine، phosphothreonine، وphosphotyrosine. 10 وهكذا، والتقنيات التي تستخدم عادة لتحليل تحركات سر / منتدى المجالس الرومانسية / صور غير قابلة للتطبيق لتحركات الحامض الاميني. وقد اقتصرت عموما 11 في فحوصات المختبر لدراسة تحركات الحامض الاميني لتصوير الإشعاع الذاتي SDS-PAGE. 12،13 في هذه الطريقة، يتم تحضين [γ- 32 ف] -ATP مع كيناز، ويتم تحليل الفسفرة من كيناز من قبل بولهلام yacrylamide الكهربائي (PAGE) تليها تصوير الإشعاع الذاتي من هلام. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة autophosphorylation كيناز، وكذلك phosphotransfer من كيناز إلى منظم استجابة. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب ملحوظة. فحوصات على أساس PAGE منخفضة الإنتاجية وتستغرق وقتا طويلا. وهذه القيود لا تساعد على تحديد خصائص البروتين والتأكد من المعلمات الحركية. طريقة بديلة لدراسة تحركات الحامض الاميني الذي نشر مؤخرا يستخدم الأجسام المضادة phosphohistidine للكشف عن autophosphorylation. 14 في حين أن هذا الأسلوب له ميزة التمييز بين 1-phosphohistidine و 3 phosphohistidine، اعتمادا على الأجهزة المستخدمة للكشف، وهذه الطريقة قد لا توفر مجموعة ديناميكية كبيرة أو الحد الأعلى عال من الكشف. وبالتالي، هناك حاجة لفحص أسرع وأقل مشقة، وأكثر حساسية والتي يمكن استخدامها لدراسة هذه البروتينات الهامة.
هنا، نحن تصف ودemonstrate فحص النيتروسليلوز وضعت بعناية ملزم التي يمكن استخدامها لتحديد autophosphorylation من النقاء تحركات الحامض الاميني البكتيرية في المختبر. هذا الاختبار هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت من المقايسات القائم على الصفحة. كما يستخدم طريقة إشعاع شيرينكوف لتقدير phosphohistidine، الذي يوفر الحد الأعلى عال من الكشف ومجموعة ديناميكية كبيرة. الفحص يمكن استخدامها لتحديد معالم الحركية للتحركات الحامض الاميني.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص النيتروسليلوز الملزمة التي وصفناها لديها العديد من المزايا أكثر الأساليب المستخدمة سابقا لوصف تحركات الحامض الاميني. بالمقارنة مع SDS / تصوير الإشعاع الذاتي التقليدي القائم على PAGE، أسلوبنا هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت. غشاء النيتروسليلوز هو أسهل للتعامل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل وزارة التربية والتعليم من خلال المساعدة الدراسات العليا في مجالات البرنامج حاجة وطنية (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
References
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
