In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Interactie tussen moleculen is de basis van de natuur. Vandaar dat wetenschappers op vele terreinen van fundamenteel en toegepast onderzoek proberen om de fundamentele principes van de moleculaire interacties van verschillende soorten te begrijpen. Microschaal Thermophoresis (MST) kunnen wetenschappers de snelle, nauwkeurige, kostenefficiënte en op kwaliteit gecontroleerde karakterisering van moleculaire interacties uit te voeren in een oplossing, met een vrije keuze van buffers. Er zijn al meer dan 1.000 publicaties met behulp van MST, van 2016 alleen al, de beschrijving van verschillende soorten analyses, met inbegrip van de bibliotheek screenings, bindende event validaties, de concurrentie assays, en experimenten met meerdere bindende partners ^1-8. Over het algemeen MST maakt de studie van de klassieke bindingsparameters, zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM), stoichiometrie en thermodynamica, van elke soort moleculaire interactie. Een groot voordeel van MST is het vermogen binding gebeurtenissen onafhankelijk van de grootte van de interactiepartners bestuderen. zelfs challenging interacties tussen kleine nucleïnezuur aptameren (15-30 nt) en targets zoals kleine moleculen, geneesmiddelen, antibiotica, of metabolieten kunnen worden gekwantificeerd.

De huidige state-of-the-art technologieën te karakteriseren aptameer-target interacties ofwel lab-intense en zeer complexe of niet te kwantificeren aptameer-klein molecuul interacties ^9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) gebaseerde assays ^11,12 en echt label-free calorimetrische benaderingen, zoals Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) ^13-15, isocratische elutie ^16, evenwicht filtratie ^17,18, in-line sonderen ^19, gel- shift assays, stoppunt fl ow fluorescentie-spectroscopie ^20,21, fluorescentie anisotropie (FA) ^22,23, single-molecule fluorescentie beeldvorming ^24,25, en Bio-layer interferometrie (BLI) ²⁶ zijn ook ofwel onnauwkeurig of niet verenigbaar met aptameer-klein molecuul interacties. andere principal vraagstukken van deze methoden zijn lage gevoeligheid, hoge monster verbruik, immobilisatie, massatransport beperkingen op oppervlakken, en / of buffer beperkingen. Slechts een paar van deze technologie te bieden geïntegreerde schakelaars voor aggregatie en adsorptie effecten.

MST is een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers om deze beperking op de interactie tussen aptameren en kleine moleculen ^27-29, alsmede andere doelen zoals eiwitten ^30-33 bestuderen overwonnen. De technologie is gebaseerd op de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten. Deze gerichte beweging, genaamd "thermophoresis," afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell van het molecuul ^34,35. De binding van een ligand aan het molecuul direct ten minste één van deze parameters verandert, wat resulteert in een veranderde mobiliteit thermophoretic. Liganden met kleine maten kan geen aanzienlijke gevolgen in termen van grootte veranderen van de niet-gebonden aan de gebonden toestand, maar ze kunnen dr hebben amatic effecten op de hydratatie shell en / of kosten. De veranderingen in de thermophoretic beweging van moleculen na interactie met de bindende partner maakt de kwantificering van fundamentele bindingsparameters ^{2,7,34,36,37.}

Zoals weergegeven in figuur 1A, de MST inrichting bestaat uit een infrarood laser gefocust op het monster in de glazen capillairen met dezelfde optiek als voor fluorescentiedetectie. De thermophoretic beweging van eiwitten via de intrinsieke fluorescentie van tryptofaan ⁶ of een fluorescent gelabelde interactiepartner ^3,8 kan worden bewaakt terwijl de laser wordt een temperatuurgradiënt (AT van 2-6 ° C). Het resulterende temperatuurverschil in de ruimte, AT, leidt tot de uitputting of accumulatie van moleculen in het gebied van verhoogde temperatuur, die kan worden gekwantificeerd door de Soret coëfficiënt (S _T):

g "/>

c _hete geeft de concentratie in het verwarmde gebied, en c _koud de concentratie in de oorspronkelijke koud gebied.

Zoals getoond in figuur 1B, een typische MST experiment resulteert in een MST bewegingsprofiel (tijddiagram), bestaande uit verschillende fasen, die gescheiden kunnen worden door hun respectieve tijdschema. De initiële fluorescentie gemeten in de eerste 5 s bij afwezigheid van de temperatuurgradiënt de precieze start fluorescentie definiëren en controleren fotobleken of photoenhancement. De temperatuursprong (T-Jump) vertegenwoordigt de fase waarin de fluorescentieveranderingen voor thermophoretic beweging. Deze initiële afname in fluorescentie afhankelijk warmte-afhankelijke veranderingen van fl uorophore kwantumopbrengst. De thermophoresis fase volgt, waarbij de fluorescentie afneemt (of verhogingen) door de thermophoretic beweging van de molecules tot de steady-state verdeling wordt bereikt.Het omgekeerde TJump en gelijktijdige terugdiffusie van fluorescerende moleculen zoals aangegeven in figuur 1B nadat de laser is uitgeschakeld worden waargenomen. Om bij fundamentele bindingsparameters worden verschillende molaire verhoudingen van de interactiepartners geanalyseerd en vergeleken. Gewoonlijk worden 16 verschillende ratio's bestudeerd in een MST experiment, terwijl de optische zichtbaar molecuul constant wordt gehouden en wordt geleverd met een toenemende hoeveelheid van de niet-gelabelde ligand. De interactie tussen de twee bindingspartners induceert veranderingen in de thermophoresis, en dus de genormaliseerde fluorescentie, F _norm, die wordt berekend als volgt:

F _warme en _koude F vertegenwoordigen gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de gedefinieerde tijdstippen van het MST sporen. Bindende affiniteiten _(Kd of EC ₅₀ waarden) kan worden berekend door curve fitting (figuur 1C).

Over het geheel genomen MST is een krachtig hulpmiddel om de moleculaire interacties van welke aard dan ook te bestuderen. Dit manuscript biedt een protocol bij de uitdagende interactie te karakteriseren tussen de kleine molecule adenosine trifosfaat (ATP; 0,5 kDa) en de 25-nt korte ssDNA aptameer DH25.42 (7,9 kDa). In de loop van het manuscript wordt de bindingsplaats van de aptameer aan het ATP molecuul in kaart gebracht naar de adenine groep van ATP.