El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
La técnica de superposición de agar blando se desarrolló originalmente hace más de 70 años y ha sido ampliamente utilizado en varios campos de investigación microbiológica, incluyendo el trabajo con los bacteriófagos y bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicos. Este enfoque es relativamente barato, con requisitos mínimos de recursos. Esta técnica consiste en la detección de sobrenadante de una cepa donante (potencialmente albergar un compuesto (s) tóxico) sobre una capa de agar blando solidificada que se siembra con una cepa de prueba bacteriana (potencialmente sensible al compuesto tóxico (s)). Hemos utilizado esta técnica para seleccionar una biblioteca de cepas de Pseudomonas syringae para matar intraespecífica. Mediante la combinación de este método con una etapa de precipitación y deleciones de genes específicos, múltiples compuestos tóxicos producidos por la misma cepa se pueden diferenciar. Los dos agentes antagónicos comúnmente recuperados usando esta técnica son bacteriófagos y bacteriocinas. Estos dos agentes se pueden distinguir empleandodos pruebas adicionales simples. Realización de una dilución en serie en un sobrenadante que contenía bacteriófago se traducirá en placas individuales haciéndose menos en número con mayor dilución, mientras que la dilución en serie de un sobrenadante que contiene bacteriocina resultará una zona de compensación que se hace uniforme más turbia con mayor dilución. Además, un bacteriófago producirá una zona de compensación cuando manchado sobre una capa de agar blando fresco sembrado con la misma cepa, mientras que una bacteriocina no producirá una zona de compensación cuando se transfiere a un césped de agar blando fresco, debido a la dilución de la bacteriocina.
Introduction
Recientemente, ha habido un interés significativo en la profundización de nuestra comprensión de la ecología microbiana (en particular las microbiomas de varios ambientes), así como nuevos compuestos antibacterianos para utilizar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos 1,2. Un tema de la interconexión entre estos intereses es la comprensión de las interacciones antagónicas entre las cepas bacterianas en su ambiente natural. Existen numerosas formas en que las bacterias antagonizan competidores 3. Las bacteriocinas, un grupo diverso de compuestos proteicos, antibacterianos, durante mucho tiempo han sido estudiados por su papel en la mediación de antagonismo interbacterial, con dos de las especies más estudiadas son Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 4,5 6, importantes patógenos humanos. Además de bacteriocinas, prophages inducidos también pueden actuar como agentes anticompetitor, lo que permite una cepa de invadir en un nicho que ya está colonizada 7. Pseudomonas syringae es un patógeno de la planta conocida para producir una gran variedad de agentes antimicrobianos, incluyendo bacteriocinas sola proteína 8, bacteriocinas de la cola de bacteriófagos derivados de 9 (denominados tailocins), así como metabolitos secundarios no proteínicos 10. Recientemente ha habido interés en la comprensión de cómo estos antimicrobianos influyen en la ecología de este organismo, así como la forma en que se pueden aprovechar para el control de enfermedades de las plantas 11.
Un método ampliamente utilizado para el estudio de ambas bacteriocinas y bacteriófago es la técnica de superposición en agar blando. Este método fue descrito por primera vez por Gratia en 1936 para ayudar en la enumeración de bacteriófago 12,13.
Aquí se describe la aplicación del método de superposición en agar blando, en combinación con la manipulación genética dirigida y precipitación con polietilenglicol (PEG), para distinguir entre los tres agentes antimicrobianos diferentes (un bacteriófago, un bact de alto peso moleculareriocin, y una bacteriocina de bajo peso molecular) producida por una única cepa bacteriana. El beneficio de este enfoque es que es relativamente simple y barato, por lo que, a pesar de ser decididamente 'baja tecnología', todavía se utiliza ampliamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de superposición de agar blando se describe aquí se ha aplicado ampliamente para muchas décadas por los investigadores interesados en bacteriófagos o bacteriocinas. Los principales beneficios de este enfoque son que es simple, barato y relativamente fácil de interpretar. Mediante la combinación de la superposición en agar blando con precipitación con PEG y de dilución en serie, los agentes antimicrobianos se pueden separar en altas frente a agentes de bajo peso molecular, y replicativas vs. no replicativo agentes (es decir, bacteriófago vs. tailocin, respectivamente). Finalmente, la incorporación de manipulación dirigida genética (supresión y complementación) de bacteriocina putativo o loci profago puede establecer firmemente la identidad de un compuesto antagonista dado. Recientemente, hemos utilizado este método para describir un nuevo derivado del bacteriófago bacteriocina frecuente entre las cepas de Pseudomonas syringae 9.
Los medios de cultivo y condiciones indicados en el presente trabajo protocolo bien para Pseudomonas SYringae y probablemente sería suficiente para otras bacterias Gram-negativas que crecen vigorosamente bajo estas condiciones. Sin embargo, los investigadores que usan este método se desea optimizar el tiempo, medio de cultivo, el método de inducción, y la temperatura de incubación para su sistema. Los parámetros críticos incluyen la inducción de la producción de cultivo, mientras que en la fase de crecimiento logarítmica, así como la siembra de la superposición en agar blando con suficiente cultivo en fase logarítmica para asegurar una distribución uniforme de bacterias, pero no excesiva cultura, que oscurecer posibles zonas de compensación. Hay muchos bacteriocinas que no son inducidas como parte de la respuesta SOS, sino que son inducidos a través de sistemas de detección de quórum basados en péptidos (en particular, las bacteriocinas Gram-positivas 15), por lo tanto, un investigador puede querer evaluar a varios métodos de inducción diferentes (por ejemplo, modificar el contenido de nutrientes del medio inductor, o permitir que para la incubación ampliada de la cepa productora).
Cuando usasesta técnica, la superposición en agar blando debe ser fundido a fondo y se mantiene a 55-60 ° C antes de la adición de la cepa de la siembra. Hemos tenido varios experimentos en los que el agar blando no se funde completamente (aunque visualmente que parecía ser) y dio lugar a una superposición con un aspecto granulado. Los resultados de una superposición de granulado pueden todavía ser generalmente interpretable, sin embargo, esto depende de la fuerza de la inhibición (inhibición más débil será más difícil de observar). A, variable de confusión final a considerar cuando se utiliza esta técnica es que se permite que la temperatura del agar fundido suficiente tiempo para enfriarse antes de la inoculación con la cepa de la siembra, con el fin de evitar la muerte de la cepa de la siembra. Para evitar este problema, nos aseguramos el agar blando es cálido, pero no caliente, para tocar. En esta línea, también hemos observado que si nos damos un tiempo inadecuado para un cultivo de siembra para aclimatarse a la agar fundido, antes de verter la superposición, que se recuperan generalmente pobre g bacterianarecimiento, que hace que la interpretación de la inhibición específica difícil o imposible de interpretar. Esto es por qué permitimos 10-15 segundos adicionales de incubación entre la vórtex y vertiendo la superposición. El equilibrio entre el mantenimiento de la agar en un estado completamente fundido (más caliente es mejor) pero no letal para la cepa de siembra (más caliente no es mejor) es uno que probablemente tendrá que ser determinado por un investigador a través de ensayo y error.
Si se utiliza una etapa de precipitación con PEG, sería beneficioso incluir un control negativo donde un medio de caldo estéril se procesa de forma idéntica al sobrenadante del cultivo. Esto asegurará que la muerte de actividad no es el resultado de PEG residual o cloroformo en el sobrenadante de la muestra.
Como ambos bacteriófagos y bacteriocinas tienden a ser altamente específico, no es raro encontrar ninguna actividad de eliminación aparente con una combinación dada de cepas. Esto puede resultar de una variedad de re-cepa específicasistance mecanismos, uno de ellos que la cepa de ensayo o bien carece o tiene una versión no reconocida de los receptores necesarios para la orientación de una bacteriocina o bacteriófago dado.
Un método alternativo, el método de detección de bacteriocina ha sido descrito por Kawai et al. , Pero adolece de inconvenientes y no ha sido ampliamente adoptado 16. Específicamente, esta técnica requiere la observación de muestras de caldo a intervalos de tiempo que pueden ser una carga, y no permite que para la discriminación entre las actividades de matanza-bacteriófagos derivados y derivados de bacteriocina.
Las principales limitaciones de esta técnica es que no es muy adecuado para los organismos que no crecen robustamente (y por lo tanto se verá privada de zonas de compensación fácilmente discernibles) o que prophages puerto o bacteriocinas que no se producen robusta en condiciones de laboratorio. La adaptación de esta técnica para detectar las bacteriocinas producidas en muestras ambientales que tanto ampliar la utilidadde esta técnica y facilitar una mayor comprensión de la función de las bacteriocinas dentro de un ambiente natural.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
