Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
A técnica de sobreposição-ágar mole foi originalmente desenvolvido mais de 70 anos atrás e tem sido amplamente utilizada em várias áreas de investigação microbiológica, incluindo o trabalho com bacteriófagos e bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicas. Esta abordagem é relativamente barata, com o mínimo de requisitos de recursos. Esta técnica consiste em detectar sobrenadante a partir de uma estirpe dadora (potencialmente tóxico que alberga um composto (s)) sobre uma camada de agar macio solidificada que é semeado com uma estirpe bacteriana de ensaio (potencialmente sensíveis ao composto tóxico (s)). Nós utilizamos esta técnica para rastrear uma biblioteca de Pseudomonas syringae estirpes de morte intra-específica. Ao combinar esta abordagem com um passo de precipitação e deleções de genes-alvo, vários compostos tóxicos produzidos pela mesma estirpe podem ser diferenciadas. Os dois agentes antagônicos comumente recuperados usando esta técnica são bacteriófagos e bacteriocinas. Estes dois agentes podem ser diferenciadas usandodois testes adicionais simples. A realização de uma diluição em série de um sobrenadante contendo o bacteriófago resultará em placas individuais se tornando menos em número com uma maior diluição, enquanto que a diluição em série de um sobrenadante contendo bacteriocina resultará uma zona de compensação, que se torna mais uniformemente turvo com uma maior diluição. Além disso, um bacteriófago vai produzir uma zona de compensação, quando visto numa camada de agar macio fresco semeada com a mesma estirpe, ao passo que uma bacteriocina não vai produzir uma zona de compensação, quando transferidos para um relvado agar mole fresco, devido à diluição da bacteriocina.
Introduction
Recentemente, tem havido um interesse significativo em aprofundar a compreensão da ecologia microbiana (particularmente os microbiomas de vários ambientes), bem como novos compostos anti-bacterianos para uso no combate a agentes patogénicos resistentes aos antibióticos 1,2. Um tema de interligação entre estes interesses é compreender as interacções antagonistas entre estirpes de bactérias em seu ambiente natural. Há inúmeras maneiras em que as bactérias antagonizam concorrentes 3. Bacteriocinas, um grupo diversificado de compostos proteicos, antibacterianos, têm sido estudados para determinar seu papel na mediação antagonismo interbacterial, com duas das espécies mais estudadas sendo Pseudomonas aeruginosa 4,5 e Escherichia coli 6, importantes patógenos humanos. Além de bacteriocinas, profagos induzidas também podem agir como agentes anticompetitor, permitindo uma estirpe para invadir um nicho que já é colonizada 7. Pseudomonas syringae é um agente patogénico de plantas conhecido por produzir uma variedade de agentes antimicrobianos, incluindo bacteriocinas única proteína 8, bacteriocinas derivado de cauda de bacterióf agos (9 tailocins denominados), bem como metabolitos secundários não proteináceos 10. Recentemente, tem havido interesse em compreender como estes antimicrobianos influenciar a ecologia deste organismo, bem como a forma como eles podem ser aproveitados para controlar doenças de plantas 11.
Um método amplamente utilizado para estudar ambos bacteriocinas e bacteriófago é a técnica de sobreposição de soft-agar. Este método foi descrito pela primeira vez por Gratia em 1936 para a ajuda ao enumerar bacteriófago 12,13.
Aqui descreve-se a aplicação do método da sobrecamada de ágar mole, em combinação com a manipulação genética direccionada e polietileno glicol precipitação (PEG), para distinguir entre os três agentes antimicrobianos diferentes (um bacteriófago, um elevado peso molecular Bacteriocin, e um baixo peso molecular bacteriocina) produzido por uma única estirpe bacteriana. A vantagem dessa abordagem é que é relativamente simples e barato, que é por isso que, apesar de ser decididamente 'low-tech', ainda é amplamente utilizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de sobreposição-ágar mole descrita aqui tem sido amplamente aplicada por muitas décadas por pesquisadores interessados em bacteriófagos ou bacteriocinas. Os principais benefícios desta abordagem é que ela é simples, barato e relativamente fácil de interpretar. Ao combinar a sobreposição soft-agar com precipitação com PEG e diluição em série, os agentes antimicrobianos podem ser separados em elevado vs agentes de baixo peso molecular, e replicativas versus não-replicativo agentes (isto é, contra bacteriófagos tailocin, respectivamente). Finalmente, a incorporação de manipulação genética alvo (supressão e complementação) de bacteriocina putativo ou loci profago firmemente pode determinar a identidade de um dado composto antagonista. Nós temos usado recentemente este método para descrever um novo bacteriófago derivado bacteriocina prevalente entre Pseudomonas syringae estirpes 9.
Os meios de crescimento e condições indicadas neste trabalho protocolo bem para Pseudomonas syringae e provavelmente suficiente para outras bactérias gram-negativas que crescem vigorosamente sob estas condições. No entanto, os investigadores usam este método vai quer para optimizar o tempo, o meio de cultura, o método de indução, temperatura de incubação e para o seu sistema. Os parâmetros críticos incluem induzir a produção de cultura, enquanto na fase logarítmica de crescimento, bem como a sobreposição semeando soft-agar com cultura em fase logarítmica suficiente para assegurar uma distribuição uniforme bacteriana, mas não excessiva da cultura, o que irá obscurecer zonas de compensação potenciais. Existem muitas bacteriocinas que não são induzidos como parte da resposta SOS, mas sim são induzidos através de sistemas de sensor de quorum baseados em péptidos (particularmente bacteriocinas Gram-positivas 15), assim, um investigador pode querer rastrear vários métodos diferentes de indução (tais como a modificação do conteúdo de nutrientes de induzir médio, ou permitindo a incubação prolongada da estirpe produtora).
quando se utilizaNesta técnica, a sobreposição soft-agar deve ser completamente derretida e mantida a 55-60 ° C antes da adição da estirpe semeadura. Tivemos várias experiências em que o agar mole não foi completamente derretido (embora visualmente parecia ser) e resultou em uma sobreposição com um aspecto granulado. Os resultados de um granulado de sobreposição pode ainda ser geralmente interpretável, no entanto, esta é dependente da força de inibição (inibição mais fraca será mais difícil de observar). Um, variável de confusão final a considerar quando se utiliza esta técnica é que a temperatura do fundido de ágar é permitido tempo suficiente para arrefecer antes da inoculação com a estirpe de sementeira, de modo a evitar a morte da estirpe de semeadura. Para evitar esse problema, podemos garantir a-agar macio é quente, mas não quente, ao toque. Ao longo destas linhas, também observamos que se dar tempo inadequado para uma cultura de semeadura para se aclimatar ao agar fundido, antes de despejar a sobreposição, recuperamos geralmente pobres g bacterianaRESCIMENTO, o que torna a interpretação de inibição específica difícil ou impossível de interpretar. É por isso que permitem 10-15 segundos adicionais de incubação entre vórtex e despejando a sobreposição. O trade-off entre a manutenção do agar em um estado completamente fundido (mais quente é melhor), mas não letal para a estirpe semeadura (mais quente não é melhor) é aquele que provavelmente terá de ser determinada por um investigador através de tentativa e erro.
Se um passo de precipitação de PEG é utilizada, seria benéfico incluir um controlo negativo, onde um meio de caldo estéril é processado identicamente ao sobrenadante da cultura. Isto irá assegurar que matar actividade não é o resultado de PEG residual ou clorofórmio dentro do sobrenadante da amostra.
Como ambos os bacteriófagos e bacteriocinas tendem a ser altamente específico, não é incomum encontrar nenhuma actividade de morte aparente, com uma dada combinação de estirpes. Isto pode resultar de uma variedade de re-específica estirpemecanismos sistência, sendo um deles de que a tensão testador quer faltas ou tem uma versão não reconhecida do receptor necessário para a segmentação por um determinado bacteriocina ou bacteriófago.
Um método alternativo, o método de rastreio de bacteriocina foi descrito por Kawai et al. , Mas sofre de desvantagens e não foi amplamente adotado 16. Especificamente, esta técnica requer observando amostras de caldo a intervalos de tempo que pode ser pesada, e não permite a discriminação entre as actividades de matança de bacteriófagos derivada e derivada bacteriocina.
As principais limitações desta técnica é que ele não é bem adequado para os organismos que não crescem de forma robusta (e, assim, faltará zonas de compensação facilmente discerníveis), ou que prophages porto ou bacteriocinas que não são robustamente produzidos sob condições de laboratório. Adaptação desta técnica para detectar bacteriocinas produzidas em amostras ambientais que tanto expandir o utilitáriodesta técnica e facilitar um maior conhecimento sobre o papel das bacteriocinas dentro de ambientes naturais.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
