ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

活性について試験するための上清の調製無菌の0.1 M 硫酸マグネシウムバッファー（ 例えば 1mgのマイトマイシンC / 2ミリリットルバッファ）に適切な量を溶解することにより、マイトマイシンCの0.5 mg / mlでストック溶液を準備します。光保護された容器内に4℃での店舗在庫（マイトマイシンCは光感受性です）。 王の培地B（KB）培養液14の3ミリリットルにP. syringaeのの単一コロニーを接種します。室温（21-25℃）で振盪（200rpm）しながら一晩インキュベートします。 次の朝は、新鮮KBブロスの3ミリリットル中に肉汁培養1/100を希釈します。室温で振とうしながら3-4時間インキュベートします。マイトマイシンC（0.5 / mlの最終濃度）を追加します。室温で振盪しながら一晩培養をインキュベートします。 注：マイトマイシンCは、バクテリオファージおよびバクテリオシンの両方の産生をもたらす、したがって細胞のSOS応答を刺激する、二本鎖DNA破壊を引き起こします。 ペレット1〜2ミリリットルマイトマイシンCは、ベンチトップ微量で5分間20,000×gで遠心分離することによって培養液を誘導しました。 削除し、0.22μmの孔サイズのフィルターを通して上清を通過させることにより、またはクロロホルム上清（1 mlの上清当たり100μlのクロロホルム）を処理することにより、いずれかの培養上清を滅菌します。 クロロホルムを使用した場合、15秒間混合物をボルテックスし、室温で1時間インキュベートしましょう。インキュベーション後、5分間20,000×gで混合物を遠心します。 注：クロロホルムが効率的にそれらの膜を可溶化することによって細胞を死滅させます。濾過滅菌を介してクロロホルムを使用する利点は、一度に多くの（> 20）のサンプルを処理した場合にアップスケーリングするために安価で容易であることです。所与の殺活性を有機相への分配の結果としてクロロホルム処理後に失われる可能性があってもよいです。 新鮮な、滅菌1.5または2.0ミリリットルに1ミリリットルピペットを用いて上部の水相を除去マイクロチューブ。 （キャリーオーバーを避けるために、水相の少ないを削除することをお勧めし）、下部クロロホルム層のいずれかを転送しないように注意してください。 残留クロロホルムを（数時間）を蒸発させるためにヒュームフードにキャップされていない転送上清をインキュベートします。 4°Cで保存上清。 ポリエチレングリコール（PEG）沈殿による高分子量殺菌化合物の2分離濃縮無菌上清に、それぞれ、1 Mおよび10％の最終濃度になるようにNaClおよびPEG 8000を追加します。 NaClおよびPEGの両方が完全に溶解するまで、繰り返しサンプルを反転。 4°Cで1時間または一晩氷浴中でサンプルをインキュベートします。 4℃で30分間、16,000×gで遠心分離サンプル。ペレットを遠心管の底に形成すべきです。上清を除去し、（そのようなオリジナルの上澄みの容量の1/10または1/100のような所望の体積でペレットを再懸濁UME）反復ピペッティングによって緩衝液（10mMのTris、10mMのMgSO 4を、pHが7.0）。 等量のクロロホルムで2連続抽出により残留PEGを除去します。 その後、5分間20,000×gで混合物を遠心分離し、10〜15秒間再懸濁したペレットとボルテックスでクロロホルムを兼ね備えています。新鮮な微量遠心管に上部の水相を転送します。水と有機相との間には白のインタフェース（通常は2回の抽出合計）見えなくなるまで、この抽出を繰り返します。残留クロロホルムをドラフト内で抽出された上清から蒸発することを可能にします。 活動のためのオーバーレイとテスト上清の調製 KBの3ミリリットルへの感受性を試験するためのP. syringaeの株の単一コロニーを接種、室温で振盪しながら一晩インキュベートします。 翌朝は、バック新鮮KBに文化1/100に希釈します。部屋のtemperatuで振盪しながら3-4時間インキュベート再。 超純水に懸濁0.35から0.7パーセント（w / v）の寒天をオートクレーブで滅菌水寒天を準備します。 注：軟水寒天の在庫は電子レンジで溶融し、繰り返し再利用することができ、新鮮なオーバーレイは、各実験のために準備する必要はありません。水寒天が再利用される場合は、完全にマイクロ波加熱以下の溶融されていることを確認することが重要です。そうでない場合、オーバーレイは解釈が困難になります固化時の粒子の粗いテクスチャを持っています。この問題が発生した場合、長い以前に行わよりも電子レンジで数分間寒天を溶かします。 使用前に60℃の水浴中で溶融した軟寒天に維持します。無菌培養チューブへの転送ソフト寒天の3ミリリットルを、無菌の血清学的ピペットを使用。溶融状態に維持するために水浴に培養チューブを返します。 最初の（それは暖かいが、熱くない感じるべき）溶融寒天を冷却することを可能にする、オーバーレイを注ぐことではなく、固化することはできません。 無菌フードでは、100μlの接種ソフトアガーと渦に試験株の文化が混在します。ボトム寒天（KB寒天）上に注ぎ、その後、10〜15秒間手で文化を回転させます。軟寒天が均等に底寒天をカバーするように、すべての方向にプレートを傾けます。 注：下の寒天は、試験株が活発に成長する上で任意の固化（1.5％寒天）培地であることができます。標準的な100ミリメートルの直径のペトリ皿のために、20ミリリットルの培地を融解〜使用。ボトム寒天（乾燥せずに4℃で維持した場合）、数週間事前に調製することができ、または同じ日に調製することができます。オーバーレイを行うと同じ日に調製した場合、それは3.4ステップするように前に行うことをお勧めします。 プレートをカバーし、それが20〜30分で固化することができます。固化しながらプレートを乱さないように注意してください。 一度オーバーレイ上に（上記のセクション1と2で生成）上澄みの2-5μlのを見つけ、固化しました。プレートを室温で一晩インキュベートすることを可能にします。観察と記録の結果、次の朝。 注記：行い、上清の連続希釈から発見することが有用であり得ます。これは、研究者は、バクテリオファージおよびバクテリオ清算活動を区別することができます。 5または1:10希釈液：この場合には、1を実行することをお勧めします。