Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
Die Soft-Agar-Overlay-Technik wurde ursprünglich vor mehr als 70 Jahren entwickelt und in verschiedenen Bereichen der mikrobiologischen Forschung, einschließlich der Arbeit mit Bakteriophagen und bacteriocins, proteinhaltiges antibakterielle Mittel in großem Umfang eingesetzt worden. Dieser Ansatz ist relativ kostengünstig, mit geringem Ressourcenbedarf. Diese Technik besteht Überstand von einem Spenderstamm von Spek (möglicherweise eine toxische Verbindung Beherbergung (n)) auf eine verfestigte weiche Agar-Deckschicht, die mit einem bakteriellen Teststamm (potentiell empfindlich gegenüber der toxischen Verbindung (en)) ausgesät wird. Wir nutzten diese Technik eine Bibliothek von Pseudomonas syringae zu screenen für innerartliche Tötung Stämme. Durch die Kombination dieser Ansatz mit einem Fällungsschritt und gezielte Gen-Deletionen, mehrere toxische Verbindungen, die durch den gleichen Stamm hergestellt werden, können unterschieden werden. Die beiden antagonistischen Mittel häufig diese Technik gewonnen verwenden, sind Bakteriophagen und bacteriocins. Diese beiden Mittel können differenziert werden unter Verwendung vonzwei einfache zusätzliche Tests. Durchführen einer seriellen Verdünnung auf einen Überstand Bakteriophagen enthält, wird in den einzelnen Plaques führen weniger an der Zahl mit größerer Verdünnung zu werden, während serielle Verdünnung eines Überstand Bacteriocin enthält eine Klärungszone führen, die mit einer größeren Verdünnung gleichmäßig mehr trüb wird. Darüber hinaus wird ein Bakteriophage eine Klärungszone erzeugen, wenn sie auf eine frische Soft-Agar-Overlay ausgesät mit dem gleichen Stamm entdeckt, während ein Bakteriocin wird keine Klärungszone erzeugen, wenn sie zu einem frischen Weichagar Rasen übertragen, um die Verdünnung des Bakteriocin zurückzuführen ist.
Introduction
Vor kurzem gab es in unser Verständnis der mikrobiellen Ökologie wesentlichem Interesse (insbesondere die microbiomes verschiedener Umgebungen), sowie neue antibakterielle Verbindungen bei der Bekämpfung von Antibiotika – resistenten Erregern 1,2 zu verwenden. Ein Verbindungs Thema zwischen diesen Interessen ist das Verständnis antagonistische Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen in ihrer natürlichen Umgebung. Es gibt zahlreiche Wege , auf denen Bakterien Konkurrenten 3 antagonisieren. Bacteriocins, eine heterogene Gruppe von protein-, antibakterielle Verbindungen, wurden für ihre Rolle längst bei der Vermittlung interbakterieller Antagonismus, mit zwei der am meisten untersuchten Spezies ist von Pseudomonas aeruginosa 4,5 und Escherichia coli 6, wichtige menschliche Krankheitserreger untersucht. Neben bacteriocins können, induzierte Prophagen auch als anticompetitor Mittel wirken, so dass ein Stamm in eine Nische zu erobern , die bereits 7 besiedelt ist. Pseudomonas syringae ist eine bekannte Pflanze Pathogen eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln zu erzeugen, einschließlich einzelnes Protein bacteriocins 8, Bakteriophagenschwanz abgeleitete bacteriocins 9 (genannt tailocins) sowie Nicht-Protein – Sekundärmetaboliten 10. In letzter Zeit hat das Interesse gewesen zu verstehen , wie diese antimikrobiellen Substanzen , die Ökologie dieses Organismus beeinflussen, und wie können sie genutzt werden , um Pflanzenkrankheiten 11 steuern.
Eine weit verwendete Methode sowohl bacteriocins und Bakteriophagen für die Untersuchung ist die Soft-Agar-Overlay-Technik. Diese Methode wurde zum ersten Mal in das Aufzählen Bakteriophagen 12,13 von Gratia 1936 zu Hilfe beschrieben.
Hier wir die Anwendung der weich Agar-Overlay-Verfahren in Kombination mit gezielten genetischen Manipulation und Polyethylenglycol (PEG) Fällung, bei der Unterscheidung zwischen drei verschiedenen antimikrobiellen Mitteln (ein Bakteriophage beschreiben, ein hochmolekulares bacteriocin, und ein niedermolekulares Bacteriocin) durch eine einzelne Bakterienstamm produziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und billig, weshalb, obwohl es entschieden "Low-Tech" zu sein, wird immer noch weit verbreitet genutzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Soft-Agar-Overlay-Technik hier beschrieben ist seit vielen Jahrzehnten von den Forschern interessiert in Bakteriophagen oder bacteriocins weit verbreitet. Die wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind, dass es ist einfach, billig und relativ einfach zu interpretieren. Durch die Kombination der Soft-Agar – Deckschicht mit PEG – Fällung und serielle Verdünnung können antimikrobielle Mittel in hohem bzw. niedrigem Molekulargewicht Mittel getrennt werden, und replikative vs. nicht replikativen Mittel (dh Bakteriophagen gegen tailocin, beziehungsweise). Schließlich kann Inkorporation von gezielte genetische Manipulation (Deletion und Komplementation) putativer Bacteriocin oder Prophagen loci fest um die Identität einer bestimmten antagonistische Verbindung herzustellen. Wir haben diese Methode vor kurzem eine neue Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin weit verbreitet unter den Pseudomonas syringae – Stämmen 9 zu beschreiben.
Die Wachstumsmedien und in diesem Protokoll Arbeit angegebenen Bedingungen gut für Pseudomonas syringae und würden für andere gramnegative Bakterien wahrscheinlich ausreichen , das kräftig unter diesen Bedingungen wachsen. Jedoch Forscher dieses Verfahren verwendet werden soll das Timing, Kulturmedium, Induktionsverfahren und Inkubationstemperatur für ihr System zu optimieren. Die kritischen Parameter sind die Produktionskultur zu induzieren, während in der logarithmischen Wachstumsphase sowie Impfen der Soft-Agar-Deckschicht mit einer ausreichenden logarithmischen Phase Kultur eine einheitliche Bakterienverteilung zu gewährleisten, aber nicht übermäßige Kultur, die potentiellen Klärungszonen verdunkeln wird. Es gibt viele Bakteriocine, die nicht als Teil der SOS – Antwort induziert , sondern werden durch peptidbasierte Quorum sensing – Systeme induziert (insbesondere Gram-positive Bacteriocine 15), damit ein Forscher möchte kann mehrere verschiedene Induktionsverfahren zu screenen (wie Modifizieren Nährstoffgehalt von Medium zu induzieren, oder so dass für längere Inkubation des produzierenden Stamm).
Beim BenutzenDiese Technik muss der Weichagar overlay gründlich vor der Zugabe des seeding Dehnung bei 55-60 ° C geschmolzen und gehalten werden. Wir haben mehrere Experimente hatten, wo die Soft-Agar nicht gründlich geschmolzen war (wenn auch visuell es zu sein schien) und führte zu einer Überlagerung mit einem körniges Aussehen. Die Ergebnisse einer körnig Overlay kann im Allgemeinen noch interpretierbar sein, aber dies auf die Stärke der Hemmung (schwächere Hemmung wird schwieriger zu beobachten) abhängig ist. Eine letzte, Verwechselung Variable zu berücksichtigen, wenn mit dieser Technik ist, dass die Temperatur des geschmolzenen Agar wird ausreichend Zeit gelassen, bevor sie mit dem Aussäen Stamm der Inokulation zu kühlen, um die Tötung der Seeding-Stamm zu vermeiden. Um dieses Problem zu vermeiden, stellen wir sicher, die Soft-Agar ist warm, aber nicht heiß, zu berühren. In dieser Richtung haben wir auch festgestellt, dass, wenn wir nicht ausreichend Zeit für eine seeding Kultur geben zum geschmolzenen Agar zu akklimatisieren, bevor die Überlagerungs Ausgießen gewinnen wir im allgemeinen eine schlechte bakterielle growth, die Auslegung der spezifischen Hemmung schwierig oder unmöglich zu interpretieren ist. Aus diesem Grund wir 10-15 zusätzliche Sekunden Inkubation zwischen Verwirbelung und Gießen der Overlay ermöglichen. Die Trade-off der Agar in einem vollständig geschmolzenen Zustand zwischen der Aufrechterhaltung (heißer ist besser), aber nicht tödlich für die Aussaat Stamm (heißer ist nicht besser) ist eine, die wahrscheinlich von einem Forscher durch Versuch und Irrtum bestimmt werden müssen.
Wenn ein PEG-Fällungsschritt verwendet wird, wäre es vorteilhaft, eine negative Kontrolle enthalten, wo eine sterile Broth-Medium identisch zu dem Kulturüberstand verarbeitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Aktivität Töten ist nicht das Ergebnis von Rest PEG oder Chloroform innerhalb des Probenüberstand.
Da beide Bakteriophagen und bacteriocins neigen hoch spezifisch zu sein, ist es nicht ungewöhnlich, mit einer bestimmten Kombination von Stämmen keinen offensichtlichen Tötungsaktivität zu begegnen. Dies kann aus einer Vielzahl von stammspezifischen re führenResistenz-Mechanismen, wobei man, dass der Stamm-Tester entweder fehlt oder hat eine unbekannte Version des von einem bestimmten Bacteriocin oder Bakteriophagen benötigt Rezeptor für das Targeting.
Ein alternatives Verfahren, Bacteriocin Screeningverfahren wurde von Kawai et al beschrieben worden. , Leidet aber unter Nachteile und hat weit 16 nicht verabschiedet. Insbesondere erfordert diese Technik broth Proben in Zeitintervallen beobachtet, die lästig sein kann und nicht für die Unterscheidung zwischen Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin und abgeleitete Abtötung Aktivitäten erlaubt.
Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist, dass es nicht gut für Organismen geeignet ist, die wachsen nicht robust (und wird somit leicht unterscheidbare Klärungszonen fehlt), oder dass Hafen Prophagen oder Bakteriocine, die nicht robust unter Laborbedingungen hergestellt. Adaption dieser Technik bacteriocins zu erkennen, in Umweltproben erzeugt würde sowohl den Nutzen erweiterndieser Technik und einen besseren Einblick in die Rolle der bacteriocins in natürlicher Umgebung erleichtern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
