L'utilisation de la technique de superposition Soft-agar à l'écran pour les composés inhibitrices produites par voie bactérienne
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
La technique d'incrustation-agar mou a été initialement développé il y a plus de 70 ans et a été largement utilisé dans plusieurs domaines de la recherche microbiologique, y compris le travail avec des bactériophages et des bactériocines, des agents antibactériens protéiniques. Cette approche est relativement peu coûteux, avec des besoins en ressources minimales. Cette technique consiste à repérer surnageant à partir d'une souche donneuse (potentiellement héberger un composé (s) toxique) sur une couche de gélose molle solidifié qui est ensemencé avec une souche bactérienne de test (potentiellement sensible au composé toxique (s)). Nous avons utilisé cette technique pour cribler une bibliothèque de Pseudomonas syringae souches pour tuer intraspécifique. En combinant cette approche avec une étape de précipitation et la délétion de gènes ciblés, plusieurs composés toxiques produits par la même souche peuvent être différenciées. Les deux agents antagonistes généralement récupérés en utilisant cette technique sont bactériophages et bactériocines. Ces deux agents peuvent être différenciés en utilisantdeux tests supplémentaires simples. Exécution d'une dilution en série sur un surnageant contenant le bactériophage se traduira par des plaques individuelles deviennent moins nombreux avec une plus grande dilution, alors que la dilution en série d'un surnageant contenant des bactériocines entraînera une zone de compensation qui devient uniformément plus turbide avec une plus grande dilution. En outre, un bactériophage produira une zone de compensation lorsque repéré sur une couche de gélose molle fraîche ensemencé avec la même souche, alors qu'un bactériocine ne produira pas une zone de compensation lorsqu'ils sont transférés sur une pelouse agar mou frais, en raison de la dilution de la bactériocine.
Introduction
Récemment, il y a eu beaucoup d' intérêt à approfondir notre compréhension de l' écologie microbienne ( en particulier les microbiomes de divers environnements), ainsi que de nouveaux composés antibactériens à utiliser dans la lutte contre les agents pathogènes résistants aux antibiotiques 1,2. Un thème d'interconnexion entre ces intérêts est de comprendre les interactions antagonistes entre les souches bactériennes dans leur milieu naturel. Il existe de nombreuses façons dont les bactéries antagonistes concurrents 3. Bactériocines, un groupe diversifié de composés antibactériens, protéiniques, ont longtemps été étudiés pour leur rôle dans la médiation de l' antagonisme interbacterial, avec deux des espèces les plus étudiées étant Pseudomonas aeruginosa 4,5 et Escherichia coli 6, agents pathogènes humains importants. En plus de bactériocines, prophages induits peuvent également agir en tant qu'agents de anticompetitor, permettant une souche d'envahir dans une niche qui est déjà colonisée 7. Pseudomonas syringae est un pathogène végétal connu pour produire un éventail d'agents antimicrobiens, y compris des bactériocines simples de protéines 8, bactériophages bactériocines arrière dérivés 9 (tailocins appelés), ainsi que des métabolites secondaires non-protéiniques 10. Récemment il y a eu intérêt à comprendre comment ces antimicrobiens influencent l'écologie de cet organisme, ainsi que la façon dont ils peuvent être exploitées pour lutter contre les maladies des plantes 11.
Un procédé largement utilisé pour étudier les deux bactériocines et le bactériophage est la technique de superposition gélose molle. Cette méthode a été décrite par Gratia en 1936 à l' aide de l' énumération bactériophage 12,13.
Nous décrivons ici l'application de la méthode de superposition de la gélose molle, en association avec la manipulation génétique ciblée et de polyéthylène glycol (PEG), pour distinguer les trois agents antimicrobiens différents (un bactériophage, d'un bact de poids moléculaire élevéeriocin et une bactériocine de bas poids moléculaire), produite par une souche bactérienne unique. L'avantage de cette approche est qu'elle est relativement simple et pas cher, ce qui explique pourquoi, malgré qu'il soit décidément «low-tech», il est encore largement utilisé.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique d'incrustation-agar mou décrit ici a été largement appliquée depuis de nombreuses décennies par des chercheurs intéressés par bactériophages ou bactériocines. Les principaux avantages de cette approche est qu'il est simple, pas cher et relativement facile à interpréter. En combinant la superposition gélose molle avec précipitation au PEG et la dilution en série, les agents antimicrobiens peuvent être séparés en élevés par rapport à des agents de bas poids moléculaire et réplicatives par rapport aux non-réplicatif agents ( par exemple un bacteriophage contre tailocin, respectivement). Enfin, l'incorporation de manipulation ciblée génétique (délétion et complémentation) de bactériocine putative ou loci prophage peut établir fermement l'identité d'un composé antagoniste donné. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour décrire une nouvelle souches bactériophage dérivé bactériocine répandue chez Pseudomonas syringae 9.
Les médias et les conditions de croissance indiqués dans ce travail de protocole bien pour Pseudomonas syringae et vraisemblablement suffire pour d' autres bactéries à Gram négatif qui croissent vigoureusement dans ces conditions. Cependant, les chercheurs qui utilisent cette méthode veulent optimiser le timing, le milieu de culture, la méthode d'induction, et la température d'incubation de leur système. Les paramètres critiques comprennent l'induction de la culture de production pendant la phase de croissance logarithmique, ainsi que l'ensemencement de la superposition de gélose molle à la culture en phase logarithmique suffisante pour assurer une distribution bactérienne uniforme, mais pas la culture excessive qui obscurcir les zones de compensation potentielles. Il y a beaucoup de bactériocines qui ne sont pas induits dans le cadre de la réponse SOS, mais sont induits par les systèmes de détection de quorum à base de peptides ( en particulier bactériocines Gram-positives 15), par conséquent, un chercheur peut vouloir filtrer plusieurs méthodes d'induction différents (tels que modifier la teneur en nutriments du milieu inducteur, ou permettant une incubation prolongée de la souche productrice).
lors de l'utilisationcette technique, le recouvrement de gélose molle doit être complètement fondu et maintenu à 55-60 ° C avant l'addition de la souche d'ensemencement. Nous avons eu plusieurs expériences où l'agar mou n'a pas été complètement fondu (bien que visuellement il a semblé être) et a donné lieu à une superposition avec un aspect granuleux. Les résultats d'un revêtement granuleux peuvent encore être généralement interprétable, cependant, cela dépend de la puissance de l'inhibition (inhibition plus faible sera plus difficile à observer). Une variable de confusion finale à considérer lors de l'utilisation de cette technique est que la température de la gélose fondue est autorisé suffisamment de temps pour refroidir avant l'inoculation avec la souche d'ensemencement, de manière à éviter de tuer la souche d'ensemencement. Pour éviter ce problème, nous assurons la-agar mou est chaud, mais pas chaud, au toucher. Le long de ces lignes, nous avons également observé que si l'on donne suffisamment de temps pour une culture d'ensemencement pour acclimater à la gélose fondue, avant de verser la superposition, nous retrouvons généralement pauvres g bactérienneroissance, ce qui rend l'interprétation de l'inhibition spécifique difficile, voire impossible à interpréter. Voilà pourquoi nous permettons à 10-15 secondes supplémentaires d'incubation entre tourbillonnement et en versant le recouvrement. Le compromis entre le maintien de l'agar-agar dans un état complètement fondu (plus chaud est mieux), mais pas létale pour la souche d'ensemencement (plus chaud est pas mieux) est celui qui sera probablement besoin d'être déterminé par un chercheur par essai et erreur.
Si une étape de précipitation, le PEG est utilisé, il serait avantageux d'inclure un contrôle négatif, où un milieu de bouillon stérile est traité de manière identique au surnageant de culture. Ceci garantira que l'activité tuant ne résulte pas du PEG résiduel ou le chloroforme dans l'échantillon surnageant.
Comme les deux bactériophages et bactériocines ont tendance à être très spécifique, il est pas rare de rencontrer aucune activité de mise à mort apparente avec une combinaison donnée de souches. Ceci peut résulter d'une variété de re spécifique de la souchedes mécanismes de sistance, l'une étant que la souche d'essai soit dépourvu ou a une version non reconnue du récepteur nécessaire pour le ciblage par une bactériocine ou un bacteriophage donné.
Une autre méthode est la méthode de criblage de bactériocine a été décrite par Kawai et al. , Mais souffre d'inconvénients et n'a pas été largement adoptée 16. Plus précisément, cette technique nécessite l'observation des échantillons du bouillon à des intervalles de temps qui peuvent être onéreux et ne permet pas la discrimination entre les activités d'abattage et de bactériophage dérivé bactériocine dérivée.
Les principales limites de cette technique est qu'il ne soit pas bien adapté pour les organismes qui ne poussent pas robuste (et donc va manquer des zones de compensation facilement discernables) ou que prophages portuaires ou bactériocines qui ne sont pas solidement produits dans des conditions de laboratoire. Adaptation de cette technique pour détecter les bactériocines produites dans des échantillons environnementaux permettrait à la fois d'élargir l'utilitéde cette technique et de faciliter une plus grande perspicacité dans le rôle des bactériocines dans les milieux naturels.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
