Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
De soft-agar overlay techniek werd oorspronkelijk meer dan 70 jaar geleden ontwikkeld en is op grote schaal gebruikt in verschillende gebieden van microbiologisch onderzoek, met inbegrip van het werk met bacteriofagen en bacteriocinen, eiwitachtige antibacteriële middelen. Deze werkwijze is relatief goedkoop, met minimale benodigde middelen. Deze techniek bestaat uit het spotten supernatant van een donor stam (potentieel herbergt een toxische verbinding (en)) op een gestold zachte agar overlay die is geënt met een bacteriële teststam (potentieel gevoelig voor de toxische verbinding (en)). We gebruik gemaakt van deze techniek voor het screenen van een bibliotheek van Pseudomonas syringae stammen voor intraspecifieke doden. Door het combineren van deze benadering met een precipitatiestap en doelgen deleties kunnen meerdere toxische stoffen door dezelfde stam te onderscheiden. De twee antagonistische agenten meestal hersteld met behulp van deze techniek zijn bacteriofagen en bacteriocinen. Deze twee middelen kunnen worden onderscheiden met behulp vantwee eenvoudige aanvullende tests. Het uitvoeren van een seriële verdunning op een supernatant die bacteriofaag zal resulteren in individuele plaques steeds minder in aantal met een grotere verdunning, terwijl seriële verdunning van een supernatant die bacteriocineproductie zal resulteren een clearing zone die wordt gelijkmatig troebeler met een grotere verdunning. Daarnaast zal een bacteriofaag een clearing zone produceren wanneer gespot op een nieuwe zachte agar overlay geënt met dezelfde stam, terwijl een bacteriocine een clearing zone niet zal produceren wanneer overgebracht naar een verse zachte agar gazon, vanwege de verdunning van het bacteriocine.
Introduction
Onlangs is er aanzienlijke belangstelling voor het verdiepen ons begrip van microbiële ecologie (met name het microbiomes van verschillende omgevingen), evenals nieuwe antibacteriële stoffen voor gebruik bij de bestrijding van antibioticaresistente pathogenen 1,2. Een tussendeur thema tussen deze belangen is het begrijpen van antagonistische interacties tussen bacteriestammen in hun natuurlijke omgeving. Er zijn tal van manieren waarop bacteriën tegenwerken concurrenten 3. Bacteriocinen, een diverse groep van eiwitachtige, antibacteriële stoffen, zijn lang bestudeerd voor hun rol bij het mediëren interbacterial antagonisme, met twee van de meest bestudeerde soort zijn Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli 4,5 6 belangrijke humane pathogenen. Naast bacteriocins, kunnen geïnduceerde prophages ook fungeren als anticompetitor agenten, waardoor een stam binnen te vallen in een niche die al wordt gekoloniseerd 7. Pseudomonas syringae is een plant pathogeen bekend dankzij haar antibacteriële middelen, waaronder enkel eiwit bacteriocins 8, bacteriofaag-tail afgeleide bacteriocinen 9 (aangeduid tailocins), alsmede niet-eiwitachtige secundaire metabolieten 10 produceren. Onlangs is er interesse is in het begrijpen hoe deze antimicrobiële middelen invloed op de ecologie van dit organisme, maar ook hoe ze kunnen worden ingezet om plantenziekte 11 beheersen.
Een veel gebruikte werkwijze voor het bestuderen van zowel bacteriocinen en bacteriofaag het soft-agar overlay techniek. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Gratia in 1936 op staatssteun in het opsommen van bacteriofaag 12,13.
Hierbij wordt de toepassing van de soft-agar overlay werkwijze beschrijven we, in combinatie met gerichte genetische manipulatie en polyethyleenglycol (PEG) precipitatie, onderscheiden drie verschillende antimicrobiële middelen (een bacteriofaag, een hoogmoleculaire bact moleculaireriocin en een gering gewicht bacteriocine molecuulgewicht) bij eenmalige bacteriestam. Het voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig en goedkoop, en daarom, ondanks dat beslist 'low-tech', nu nog steeds veel toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
De soft-agar overlay techniek die hier beschreven is op grote schaal toegepast voor vele decennia door onderzoekers geïnteresseerd in bacteriofagen of bacteriocinen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn dat het eenvoudig, goedkoop en relatief gemakkelijk te interpreteren. Door de zachte agar overlay met PEG-precipitatie en seriële verdunning kunnen antimicrobiële middelen worden gescheiden in hoge versus lage gewicht moleculair middelen en replicatieve versus niet-replicatieve agentia (bijvoorbeeld bacteriofaag vs. tailocin respectievelijk). Tenslotte incorporatie van gerichte genetische manipulatie (deletie en complementatie) van vermeende bacteriocineproductie of profaag loci kan stevig de overeenkomst van een bepaalde antagonistische verbinding stellen. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze methode om te beschrijven een nieuwe bacteriofaag afgeleid bacteriocineproductie voorkomt onder Pseudomonas syringae stammen 9.
De groei van de media en de voorwaarden vermeld in dit protocol werken goed voor Pseudomonas syringae en waarschijnlijk voldoende voor andere Gram-negatieve bacteriën die krachtig groeien onder deze omstandigheden. Echter, de onderzoekers gebruik van deze methode wil je de timing, kweekmedium, inductie-methode, en de incubatie temperatuur voor hun systeem te optimaliseren. De kritische parameters omvatten het induceren van de productie van cultuur terwijl in de logaritmische groeifase en zaaien de soft-agar overlay voldoende logaritmische fase kweek een bacteriële gelijkmatige verdeling ontstaat, maar niet overdreven cultuur, die potentiële clearing zones verduisteren. Er zijn vele bacteriocinen die niet als onderdeel van de SOS respons geïnduceerd, maar worden geïnduceerd door middel van op peptide gebaseerde quorum sensing systemen (vooral Gram-positieve bacteriocines 15), dus een onderzoeker zou willen verschillende inductie methoden screenen (zoals modificeren voedingswaarde van inducerend medium, of waardoor langere incubatie van de producerende stam).
Tijdens gebruikdeze techniek, moet de zachte agar overlay grondig gesmolten en gehandhaafd op 55-60 ° C vóór de toevoeging van de stam zaaien. We hebben verschillende experimenten waarbij de soft-agar werd niet grondig smolt (hoewel visueel bleek te zijn) en resulteerde in een overlay met een korrelige uitstraling gehad. Resultaten van een korrelig overlay kan nog interpreteerbaar algemeen, maar dit is afhankelijk van de sterkte van de remming (zwakkere remming zal moeilijker waar te nemen zijn). Een laatste verstorende variabele te overwegen bij het gebruik van deze techniek is dat de temperatuur van het gesmolten agar tijd afkoelen vóór inoculatie met het zaaien stam, om te voorkomen dat het doden van de seeding stam wordt toegestaan. Om dit probleem te voorkomen, we zorgen voor de soft-agar is warm, maar niet heet, aan te raken. Langs deze lijnen, hebben we ook opgemerkt dat, indien we geven onvoldoende tijd voor een seeding cultuur te acclimatiseren aan de gesmolten agar, voorafgaand aan het gieten van de overlay, we herstellen het algemeen slecht bacteriële gGROEI, waardoor de interpretatie van specifieke remming moeilijk of onmogelijk te interpreteren. Dit is waarom we toestaan 10-15 extra seconden incubatie tussen vortexen en het gieten van de overlay. De wisselwerking tussen het handhaven van de agar in een volledig gesmolten toestand (warmer is beter) maar niet dodelijk voor het zaaien stam (warmer is beter) één die waarschijnlijk zullen door een onderzoeker te bepalen door middel van trial and error.
Als een PEG precipitatie stap wordt gebruikt, zou het nuttig zijn om een negatieve controle waarbij een steriel kweekmedium identiek is verwerkt om de kweeksupernatant worden omvatten. Dit garandeert dat dodende activiteit niet het gevolg van overblijvende PEG of chloroform in het monster supernatant.
Aangezien zowel bacteriofagen en bacteriocinen vaak zeer specifiek te zijn, is het niet ongewoon om geen duidelijke dodende activiteit problemen met een bepaalde combinatie van stammen. Dit kan resulteren uit verschillende stamspecifieke resistance mechanismen, een wezen dat de tester stam ofwel ontbreekt of heeft een onbekende versie van de receptor die nodig is voor het richten van een bepaalde bacteriocine of bacteriofaag.
Een alternatieve methode is bacteriocine screeningswerkwijze is beschreven door Kawai et al. , Maar lijdt aan nadelen en is niet op grote schaal aangenomen 16. In het bijzonder, deze techniek vereist het observeren bouillon monsters op tijdstippen dat belastend kan zijn, en staat niet toe dat de discriminatie tussen bacteriofaag-afgeleide en bacteriocineproducer afgeleide doden activiteiten.
De belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat deze niet goed geschikt is voor organismen die niet robuust doen toenemen (en dus zal gemakkelijk herkenbaar zones van klaring ontbreekt) of die de haven of prophages bacteriocinen die niet robuust worden geproduceerd onder laboratoriumomstandigheden. Aanpassing van deze techniek om bacteriocins geproduceerd in het milieu monsters zouden zowel uitbreiding van het hulpprogramma op te sporenvan deze techniek en de bevordering van het wederzijds inzicht in de rol van bacteriocines binnen de natuurlijke omgeving.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
