استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
وقد تم تطوير تقنية تراكب لينة أجار أصلا منذ أكثر من 70 عاما، واستخدمت على نطاق واسع في العديد من المجالات البحثية الميكروبيولوجي، بما في ذلك العمل مع البكتيريا وbacteriocins، وكلاء المضادة للبكتيريا البروتينية. هذا النهج غير مكلفة نسبيا، مع الحد الأدنى من الاحتياجات من الموارد. وتتكون هذه التقنية من اكتشاف طاف من سلالة المانحة (يحتمل أن تأوي مركب سام (ق)) على تراكب أجار لينة طدت التي بذرت مع سلالة بكتيرية اختبار (يحتمل أن تكون حساسة لمركب سام (ق)). نحن تستخدم هذه التقنية لفحص مكتبة الزائفة syringae سلالات عن مقتل ضمن النوع. من خلال الجمع بين هذا النهج مع خطوة هطول الأمطار والحذف الجينات المستهدفة، المركبات السامة المتعددة التي تنتجها نفس السلالة يمكن أن تكون متباينة. وكلاء عدائية اثنين تعافى عادة باستخدام هذه التقنية والبكتيريا وbacteriocins. يمكن التفرقة بين هذه العميلين باستخداماختبارين إضافية بسيطة. سوف يؤدون التخفيف المتسلسل على طاف تحتوي على الجراثيم يؤدي في لويحات الفردية أصبحت أقل في عدد بمزيد من التخفيف، في حين التخفيف المتسلسل من طاف تحتوي على مبيد جرثومي سيؤدي منطقة المقاصة أن يصبح موحد أكثر عكر بمزيد من التخفيف. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجراثيم تنتج منطقة المقاصة عندما رصدت على تراكب أجار لينة جديدة المصنف مع نفس السلالة، في حين سوف مبيد جرثومي لا تنتج منطقة المقاصة عند نقلها إلى الحديقة أجار لينة جديدة، نظرا لتخفيف من مبيد جرثومي.
Introduction
في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام كبير في تعميق فهمنا لعلم البيئة الميكروبية (وخاصة microbiomes من بيئات مختلفة)، وكذلك المركبات المضادة للبكتيريا جديدة لاستخدامها في مكافحة الجراثيم المقاومة للمضادات الحيوية 1،2. وموضوع الربط بين هذه المصالح هو فهم التفاعلات العدائية بين السلالات البكتيرية في بيئتها الطبيعية. هناك العديد من الطرق التي البكتيريا تقلد المنافسين 3. Bacteriocins، مجموعة متنوعة من البروتينية، ومركبات مضادة للجراثيم، منذ فترة طويلة ودرس لدورهم في التوسط العداء interbacterial، مع اثنين من الأنواع الأكثر درس يجري الزائفة الزنجارية 4،5 والقولونية 6، مسببات الأمراض البشرية الهامة. بالإضافة إلى bacteriocins، يمكن prophages يسببها أيضا بمثابة وكلاء anticompetitor، والسماح لسلالة لغزو إلى مكانة التي استعمرت بالفعل 7. الزائفة الصورةyringae هو الممرض النباتات المعروفة لإنتاج مجموعة من العوامل المضادة للجراثيم، بما في ذلك bacteriocins واحدة بروتين 8، عاثية bacteriocins المستمدة ذيل 9 (tailocins تسميته)، وكذلك المركبات الثانوية غير البروتينية 10. في الآونة الأخيرة كان هناك اهتمام في فهم كيفية تأثير هذه مضادات الميكروبات في البيئة من هذا الكائن الحي، وكذلك الكيفية التي يمكن تسخيرها للسيطرة على الأمراض النباتية 11.
وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة كل من bacteriocins والجراثيم هو الأسلوب تراكب الناعمة أجار. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة على سبيل الهبة في عام 1936 للمساعدة في تعداد عاثية 12،13.
نحن هنا وصف تطبيق طريقة تراكب لينة أجار، بالاشتراك مع التلاعب الجيني المستهدف والبولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار، في التمييز بين ثلاثة مضادات حيوية مختلفة (أ الجراثيم، عالية الوزن الجزيئي جرثومةeriocin، وانخفاض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي) التي تنتجها السلالة البكتيرية واحد. الاستفادة من هذا النهج هو أنه بسيط نسبيا ورخيصة، وهذا هو السبب، على الرغم من كونها بالتأكيد "التكنولوجيا المنخفضة، لا تزال تستخدم على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية تراكب لينة أجار هو موضح هنا تم تطبيق على نطاق واسع لعقود عديدة من قبل الباحثين المهتمين في البكتيريا أو bacteriocins. الفوائد الرئيسية لهذا النهج هي أنه بسيط ورخيص وسهل نسبيا لتفسير. من خلال الجمع بين تراكب لينة أجار مع PEG هطول الأمطار والتخفيف المتسلسل، العوامل المضادة للجراثيم يمكن فصلها إلى ارتفاع مقابل انخفاض كلاء الوزن الجزيئي، وتنسخي مقابل غير تنسخي وكلاء (أي الجراثيم مقابل tailocin، على التوالي). وأخيرا، دمج التلاعب الجيني المستهدفة (الحذف وتكامل) من مبيد جرثومي المفترضة أو مواضع طليعة العاثية يمكن ترسيخ هوية مركب معاد معين. وقد استخدمنا هذه الطريقة مؤخرا لوصف جديد الجراثيم المستمدة من مبيد جرثومي واسع الإنتشار بين الزائفة syringae سلالات 9.
وسائل الإعلام نمو والشروط المشار إليها في هذا العمل بروتوكول جيدا لالزائفة سيسوف ringae ومن المرجح تكفي لالجراثيم سلبية الغرام الأخرى التي تنمو بقوة في ظل هذه الظروف. ومع ذلك، فإن الباحثين باستخدام هذا الأسلوب يريدون تحقيق أفضل توقيت، مستنبت، طريقة الاستقراء، ودرجة حرارة الحضانة لنظامهم. وتشمل المعلمات الحرجة حمل الثقافة المنتجة بينما في مرحلة النمو لوغاريتمي، وكذلك بذر تراكب لينة أجار مع ما يكفي من ثقافة مرحلة لوغاريتمي لضمان توزيع البكتيرية موحد، ولكن ليس ثقافة المفرطة، والتي سوف تحجب مناطق المقاصة المحتملة. هناك العديد من bacteriocins التي لا يسببها كجزء من استجابة SOS، بل وبفعل من خلال أنظمة الاستشعار عن النصاب القائم على الببتيد (خاصة bacteriocins إيجابية الجرام 15)، وبالتالي، الباحث قد ترغب في فحص عدة طرق تحريض مختلفة (مثل تعديل المحتوى الغذائي للحمل المتوسطة، أو السماح للحضانة طويلة من سلالة إنتاج).
عند استخدامهذه التقنية، وتراكب لينة أجار يجب أن ذابت تماما والحفاظ على 55-60 درجة مئوية قبل إضافة سلالة البذر. لقد كان لدينا العديد من التجارب حيث لم يكن ذابت أجار لينة تماما (على الرغم بصريا يبدو أن يكون) وأسفرت عن تراكب مع ظهور محبب. النتائج من تراكب محببة يمكن أن تكون للتفسير عموما، ولكن هذا يعتمد على قوة تثبيط (تثبيط الأضعف سيكون من الصعب مراقبة). A، يتيه متغير النهائي في الاعتبار عند استخدام هذه التقنية هو أن يسمح للحرارة أجار المنصهر الوقت الكافي لتبرد قبل التلقيح مع سلالة البذر، وذلك لتجنب قتل سلالة البذر. لتجنب هذه المشكلة، ونحن ضمان أجار لينة دافئة، ولكن ليست ساخنة، للمس. على طول هذه الخطوط، لاحظنا أيضا أنه إذا نعطي وقتا كافيا للثقافة البذر ليتأقلم مع أجار المنصهر، وذلك قبل صب تراكب، نستعيد الفقراء عموما ز البكتيريةrowth، مما يجعل تفسير تثبيط محددة من الصعب أو من المستحيل تفسير. هذا هو السبب في أننا نسمح 10-15 ثانية إضافية من الحضانة بين vortexing لوسكب التراكب. المفاضلة بين الحفاظ على أجار في حالة منصهرة تماما (سخونة أفضل) ولكن غير مميتة للسلالة البذر (سخونة ليست أفضل) هي واحدة من شأنها أن تحتاج المرجح أن يحددها الباحث من خلال التجربة والخطأ.
إذا تم استخدام خطوة هطول PEG، سيكون من المفيد لتشمل مراقبة سلبية حيث تتم معالجتها وسيلة مرق عقيم مماثل لطاف الثقافة. وسوف يضمن هذا مما أسفر عن مقتل النشاط ليس نتيجة PEG المتبقية أو الكلوروفورم داخل طاف العينة.
كما تميل كل من البكتيريا وbacteriocins أن تكون محددة للغاية، فإنه ليس من غير المألوف لمواجهة أي نشاط قتل على ما يبدو مع مجموعة معينة من السلالات. هذا يمكن أن تنجم عن مجموعة متنوعة من سلالة محددة إعادةآليات مقاومة لأ، واحد هو أن سلالة اختبار إما يفتقر أو لديه نسخة غير المعترف بها من مستقبلات اللازمة لاستهداف من قبل مبيد جرثومي معين أو الجراثيم.
طريقة بديلة، وقد وصفت طريقة الفرز مبيد جرثومي بواسطة كاواي وآخرون. ، لكنها تعاني من عيوب ولم يعتمد على نطاق واسع (16). على وجه التحديد، وهذا الأسلوب يتطلب مراقبة عينات مرق في فترات زمنية يمكن أن تكون مرهقة، ولا تسمح للتمييز بين الأنشطة قتل عاثية المشتقة ومبيد جرثومي المشتقة.
القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه ليس مناسبة تماما للكائنات التي لا تنمو بقوة (وبالتالي سوف تفتقر مناطق المقاصة ملحوظ بسهولة) أو أن prophages الميناء أو bacteriocins التي لا تنتج بقوة تحت ظروف المختبر. التكيف هذه التقنية للكشف عن bacteriocins المنتجة في عينات بيئية من شأنه أن كلا توسيع الأداة المساعدةمن هذه التقنية وتسهيل مزيد من التبصر في دور bacteriocins داخل البيئات الطبيعية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
