말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

인간의 과목을 포함하여 모든 실험은 지역 윤리위원회 (승인없이. 3/2/14)에 의해 승인되었습니다. 환자의 선택을위한 그러한 성별, 나이, 현재 치료 요법 때문에 혈액 MV 조성물 영향과 수 많은 여러 요인 컬렉션 22,23 샘플링하기 전에 고려되어야한다는 것을 주목해야한다. 플라즈마 샘플 1. 준비 EDTA (1.6 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 vacutainer 혈액 수집 튜브에 21 게이지 나비 바늘을 통해 기증자 당 혈액이 튜브 – 1을 그립니다. 효율적인 혈액 응고를 보장하기 위해 관 (들)을 여러 번 반전해야합니다. 참고 : – 15 mL의 후속 유동 세포 계측법과 서양 얼룩 분석을위한 혈액의 권장 용량은 5입니다. MV 열화 및 손실을 방지하기 위하여 혈액 샘플을 30 분 혈액 회수 후에 <취급되어야한다. 1,200 XG에에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하여 혈장 샘플을 준비실온 (RT). 혈액 세포 (= 하층) 잔류 플라즈마 (= 상층)의 분리를 돕기 위해 밸브 필터를 적용한다. 15 ㎖의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. 1,500 XG에 15 분 동안 원심 분리, RT는 큰 세포 파편 펠렛 및 남은 혈소판을 제거합니다. 15 ㎖의 튜브에 뜨는을 전송하고 직접 -20 ° C에서 최대 6 개월 MV 격리 또는 저장 샘플을 진행합니다. 주 : 제시된 프로토콜은 세포 배양 상청액에서 MV를 (그리고 EXOS)을 분리하는데 사용될 수있다. (24) 80 % 컨 플루 – -이를 위해, 60 ℃에서 세포를 배양 소포 고갈 FCS로 보충 된 배지에서 48 시간 후 상층 액을 수집한다. 750 XG에 5 분, 4 ° C를위한 원심 분리기, 잔류 떠있는 세포를 고갈 큰 세포 파편을 펠렛 1,500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 다시 새로운 15 mL의 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 채우기 위해. 이 상등액을 다음 조작량의 분리를 위해 사용될 수있다2.16 – 2.1 단계에 설명 된대로. MV를 2. 분리 적절한 원심 관에 혈장 샘플을 옮긴다. 필요한 경우, 원심 분리 과정에서 박벽 관 붕괴 샘플을 희석 방지하기 위해 PBS로 관을 채운다. 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 원심 분리기. 가만히 따르다 뜨는, 튜브가 거꾸로 서서 종이 타월에 넣어 보관하십시오. 나머지 상층 액은 수건에 적셔하여 샘플에서 제거 될 때까지 5 분 – 3를 기다립니다. 1000 μL PBS의 MV 펠렛을 재현 탁, 탁상 원심 분리기에서 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 1.5 mL의 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. 기음 뜨는. 펠렛의 크기에 따라, 500 μL PBS – 50에서 MV 펠렛을 재현 탁. 대안 적으로, RIPA 완충액 예를 Lyse 직접 MV를, (150 mM의 염화나트륨 / 0.1 % SDS / 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 – / 1 % 트리톤 X-100 / 50mM 트리스, pH를 7.2)이후 웨스턴 블롯 분석. -20 ° C에서 보관 MV를. 그들은 몇 달 동안 안정적으로 유지하지만, 반복 동결 – 해동 사이클을 방지 할 수 있습니다. 선택적 : MV 수율을 평가 또는 후속 실험 MVS를 투약하기 위해 단백질 분석과 MV 단백질 농도 (예를 들어, 브래드 포드 또는 로우리 법) 결정한다. 추가 EXOS 플라즈마 샘플에서 분리 될 경우, 110,000 XG, 4 ° C에서 2 시간에 대한 초 원심 분리 튜브와 원심 분리기로 단계 2.3에서 뜨는을 가만히 따르다. 단계 2.3에 설명 된대로 뜨는을 가만히 따르다, 1,000 μL PBS에 출 펠렛을 재현 탁하고 작은 (1.5 mL)을 초 원심 튜브에 전송합니다. 75 μL PBS 또는 RIPA 버퍼 – 50 110,000 XG, 4 ° C, 기음 뜨는 및 재현 탁 출 펠릿에서 2 시간 동안 초 원심 분리기. 유동 세포 계측법에 의해 MV를 3. 특성 이전 15 μL PBS + 1 % 소포 고갈 소 태아 혈청 (F유동 세포 계측법 튜브 CS). 주 : 소포 고갈 된 FCS (24)는 이전에 설명 된 바와 같이 0.2 ㎛의 필터로 상청액을 110,000 XG에서 18 시간 동안 FCS (56 ° C에서 30 분) 열 – 불 활성화를 원심 분리 및 여과에 의해 제조된다. PBS에서 MV를 (3 μg의도 적용 할 수있는 낮은 수율의 경우) 5 μg의 추가. 조작량 표면에서 비특이적 결합 부위를 차단함으로써, 배경 얼룩을 감소시키기 위해 실온에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션. 단백질의 관심에 대해 형광 표지 된 항체를 추가합니다. 낮은 신호 – 대 – 잡음비를 최적 농도를 결정하고 보장하기 위하여 사용하기 전에 염색에 사용 된 항체의 양을 적정한다. 또한 음성 대조군으로 염색 MV를 하나의 튜브 (항체의 1 μg의 사용하는 경우 예를 들어, 또한 이소 제어 1 μg의를 사용하는 것과 동일한 농도로 일치하는 이소 타입 대조군 항체로 염색 MV를 하나 튜브를 포함해야합니다tibody) 배경 염색을 정량화한다. 주 : 다른 형광 색소에 결합 된 다수의 항체를 첨가하여 세포 계측법 다색 플로우를 실행하는 것도 가능하다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 품어. 250 μL PBS를 추가하고 사이토 흐름을 사용하여 샘플의 측정을 진행합니다. 경우에 시료를 즉시 측정 할 수없는, 4 ° C에서 샘플 및 저장소를 해결하기 위해 150 μL PBS 50 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이다. 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. 가능한 최저 값으로 흐름 cytometer의 임계 값을 줄이고 로그 스케일의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 앞으로 분산 형 (FSC)를 사용하여 MV 인구를 검색합니다. 뮤직 비디오 인구에 게이트 및 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다. 웨스턴 블로 팅에 의해 MV를 4. 특성 에서 직접 MV 펠렛을 재현 탁적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액). 적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액)에서 1 : MV 펠릿 이미 PBS에 재현 탁 된 경우에, 그것을 적어도 1 희석. 로우리 분석법에 의해 MV 샘플의 단백질 농도는, 예를 결정. 22.5 μL RIPA 버퍼에 MV를 20 μg의 – (10)를 준비합니다. 그런 다음 95 ℃에서 5 분 동안 7.5 μL 배 램 믈리 로딩 버퍼와 열을 추가 할 수 있습니다. 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 샘플 및 표준 프로토콜에 따라 전기 영동 및 면역를 수행합니다. 막에 단백질을 전송 한 후, 표준 프로토콜에 따라 부하 제어 등의 개양귀비 빛 염색을 수행합니다. 실온에서 5 분간 TBST에 Destain 막. TBST에서 5 % BSA에서 실온에서 최대 1 시간 30 분 동안 차단 막. 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 39 ° C에서 차 항체와 함께 막을 인큐베이션. TBST 3 × 5 분으로 막을 씻으십시오. 1의 희석에 HRP 결합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어 : 10,000 5 %의 BSA를. 주 : 높은 배경 신호의 경우, 대신 BSA의 분유를 사용한다. TBST 3 배 5 분에 막 씻으십시오. ECL 검출 시약 막을 개발하고 화학 발광 필름 또는 화학 발광 이미징 시스템에서 신호를 검출한다. 참고 EXOS에서 MVS를 구별하기 위해, 튜 불린 등의 단백질이 사용될 수있다 4 티닌 또는 mitofilin 주로 16,25 조작량에 존재해야한다. EXOS 마커로서 사용되는 대부분의 tetraspanin 항체 (예, CD9, CD81)은, 환원 조건에서 작동하지 않으며, 따라서, 70 ° C에서 10 분 동안 가열 하였다 비 환원성 로딩 완충액을 제조한다주의.