JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55057
, , , ,
1Department of Hematology/Medical Oncology,University Medical Center Göttingen

Summary

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Abstract

Die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) einschließlich kleiner Endosomen-derived Exosomen (Exos, Durchmesser <100 nm) und großen Plasma-Membran-derived microvesicles (MVs, Durchmesser> 100 nm) ist ein grundlegender zellulärer Prozess, der in allen lebenden Zellen vorkommt. Diese Vesikel Transportproteine, Lipide und Nukleinsäuren , die spezifisch für die Ursprungszelle und in vitro – Studien haben ihre Bedeutung als Mediatoren der interzellulären Kommunikation hervorgehoben. EVs wurden aus verschiedenen Körperflüssigkeiten erfolgreich isoliert und vor allem EVs im Blut haben als vielversprechende Biomarker für Krebs oder Infektionskrankheiten identifiziert worden. Um die Untersuchung der MV-Subpopulationen in Blut zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll für die standardisierte Isolierung und Charakterisierung von MVs aus peripheren Blutproben. MVs werden aus EDTA-antikoaguliertem Plasma-Proben durch Differential-Zentrifugation pelletiert und besitzen typischerweise einen Durchmesser von 100-600 nm. Aufgrund ihrer größeren Größe, können sieleicht mittels Durchflusszytometrie untersucht werden, eine Technik, die in den meisten Labors in der klinischen Diagnostik und zur Verfügung routinemßig verwendet wird. Mehrere Beispiele für die Qualitätskontrolltests der isolierten MVs werden gegeben, und die Marker, die für die Unterscheidung von unterschiedlichen Subpopulationen MV in Blut verwendet werden können, vorgestellt.

Introduction

In den letzten Jahren viele In – vitro – Studien haben gezeigt , dass extrazelluläre Vesikel (EVs) eine wichtige Rolle bei der interzellulären Kommunikation spielen. Lebende Zellen ständig Schuppen Bläschen, die in Größe, Inhalt und Biogenese unterscheiden. Die am besten untersuchten EVs sind Exosomen, die aus dem endosomalen System stammen, wo sie als intraluminale Vesikel in multivesicular Körper gespeichert werden. Wenn dieser Sicherung mit der Plasmamembran werden die enthaltenen Vesikel als Exosomen freigegeben (Exos, Durchmesser 30 bis 100 nm 1). Eine zweite Population von EV , die in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat zunehmende Aufmerksamkeit sind große microvesicles (MVs, Durchmesser 100 – 1000 nm) , die direkt aus der Plasmamembran 2 abgeschnürt.

Beide Arten von Vesikeln sind durch eine Lipiddoppelschicht umgeben und enthalten Nukleinsäuren, beispielsweise DNA, mRNA oder miRNA 3 bis 5, und eine Vielzahl von Proteinen , die sie an benachbarte c übertragenells. Während die Proteinzusammensetzung der Vesikel im allgemeinen den Stand der Ursprungszelle reflektiert scheinen einige Proteine selektiv gezielte und 1 auf EVs angereichert werden. Ein Hauptforschungsinteresse ist EVs von anormalen und kranken Zellen zu charakterisieren, um spezifische EV Signaturen zu definieren, die die Verwendung von EVs als neue Biomarker erlauben könnten. Insbesondere in der Krebstherapie, in denen häufig der Tumor selbst nicht leicht zugänglich ist , flüssige Biopsien tumorspezifische EVs in Blut Targeting könnte Überwachung der Therapie Antworten zulassen oder helfen , den Primärtumor ohne die Notwendigkeit für invasive Prozeduren 6 charakterisieren.

Tatsächlich haben EVs bereits aus verschiedenen Körperflüssigkeiten , einschließlich Urin 7, CSF 8, Muttermilch 9 oder Blut 10 erfolgreich isoliert. Mehrere Studien Veränderungen in der EV zählt und Zusammensetzung in verschiedenen menschlichen Krankheiten identifiziert. Beispielsweise ist die Anzahl der pro-Koagulans MVs in Sepsis-Patientendeutlich erhöht im Vergleich zu gesunden Personen 11. Auch bei Patienten mit schwerer Malaria cerebralis eine Zunahme der Gesamt MVs in Blut beobachtet und zählt von 12 mit Koma Tiefe und Thrombozytopenie korrelieren platelet-derived MVs werden. Andere Studien berichten , erhöhte Anzahlen von Endothel-abgeleitete Vesikel in Patienten mit systemischem Lupus erythematodes oder Herzinsuffizienz und im Fall des letzteren, dies mit einer höheren Wahrscheinlichkeit von kardiovaskulären Ereignissen korreliert 13,14.

Vor allem in der Krebstherapie, EVs in Blut werden derzeit als neue Biomarker mit diagnostischen und prognostischen Wert diskutiert. Ebenen der MVs exprimierenden Tumor-assoziierten Proteinen, wie MUC1, EGFR oder FAK scheinen im Blut von Brustkrebspatienten 15,16 angehoben werden. Auch für Exos haben neuere Studien gezeigt, dass Blut gewonnenen Exos trägt tumorspezifische Antigene wie Glypican-1 bei Bauchspeicheldrüsenkrebs oder Del-1 bei Brustkrebs im frühen Krankheits de erlaubenSchutz mit hoher Spezifität und Sensitivität 17,18. Zusätzlich Serum abgeleitetes Tumor Exos kann DNA enthalten , die für den Nachweis von Mutationen , wie beispielsweise K – Ras und p53 verwendet werden können , die für die Therapie Prädiktion 19 ihre Verwendung vorschlägt. Jüngste Fortschritte haben , dass die Analyse von Exos im Blut von Patienten mit Glioblastom gezeigt , die eine spezifische Mikrofluidik – Chip mit 20 Therapiekontrolle ermöglicht. Zusammengenommen bedeuten diese Ergebnisse, dass die Analyse von krankheitsspezifischen Subpopulationen von Vesikeln wertvolle Informationen über die Diagnose, Prognose sowie therapeutische Möglichkeiten und Erfolg gibt.

Die Isolierung und Analyse von Exos aus Blut ist zeitraubend, erfordert eine spezielle Laborausrüstung und ist daher noch nicht geeignet für die klinische Routinediagnostik. Im Gegensatz dazu kann MVs isoliert werden viel schneller und aufgrund ihrer größeren Größe, kann leicht mittels Durchflusszytometrie analysiert werden , ohne die Notwendigkeit , um sie an die Latexperlen , wie es für Exos 18 notwendig ist ,, 21. Somit stellen wir hier ein Protokoll, das für die standardisierte Isolierung von MVs aus Blutproben und die anschließende Charakterisierung von MV-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann. Dieses Protokoll wird die weitere Untersuchung und in der Tiefe Charakterisierung von MV Profile in großen Patientengruppen ermöglichen, die erforderlich werden MVs für die tägliche klinische Diagnostik zu verwenden.

Protocol

Alle Experimente mit menschlichen Probanden wurden von der Ethikkommission genehmigt (Genehmigung Nr. 3/2/14). Für die Wahl des Patienten sollte beachtet werden , dass mehrere Faktoren wie Alter, Geschlecht, Stromtherapieschemata und viele mehr beeinflussen können MV Zusammensetzung in Blut und daher in Betracht gezogen werden sollten vor Sammlung 22,23 abzutasten. 1. Herstellung von Plasmaproben Draw 1-2 Röhrchen Blut pro Spender durch eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel in einen Vacutainer Blutentnahmeröhrchen mit EDTA (1,6 mg / ml Blut). Achten Sie darauf, die Röhre (n) mehrmals zu invertieren effizient Blut Antikoagulation zu gewährleisten. HINWEIS: Die empfohlene Menge an Blut für die anschließende Durchflusszytometrie und Western Blot-Analyse ist von 5 bis 15 ml. Um MV Abbau und Verlust, Blutproben zu verhindern, sollte <30 Minuten nach der Blutentnahme behandelt werden. Bereiten Plasmaproben, indem die Proben bei 1200 × g für 15 min Zentrifugieren beiRaumtemperatur (RT). Tragen Sie eine Ventilfilter, um die Trennung von Plasma (= obere Schicht), um aus den verbleibenden Blutzellen (= untere Schicht). Übertragen Sie das Plasma in einem 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge für 15 min bei 1500 xg, RT zu pelletieren größere Zelltrümmer und entfernen restliche Plättchen. Übertragen Sie den Überstand in ein 15 ml-Röhrchen und direkt weiter mit MV Isolation oder Lagerung von Proben für bis zu 6 Monate bei -20 ° C. HINWEIS: Die vorliegende Protokoll kann auch verwendet werden MVs zu isolieren (und Exos) aus Zellkulturüberständen. Um dies zu tun, kultivieren Zellen bei 60-80% Konfluenz für 24 bis 48 h in Kulturmedium mit Vesikel verarmten FCS ergänzt, und dann den Überstand zu sammeln. Zentrifuge für 5 min bei 750 · g, 4 ° C Rest schwebenden Zellen abzureichern, füllen Sie den Überstand in ein neues 15 ml Zentrifugenrohr und erneut 5 min bei 1500 xg, 4ºC größere Zelltrümmer zu pelletieren. Dieser Überstand kann dann für die Isolierung von MVs verwendet werdenwie in Schritt 2.1 beschrieben – 2.16. 2. Isolierung von MVs Übertragen die Plasmaprobe in einem geeigneten Zentrifugenröhrchen. Falls erforderlich, füllen Rohr mit PBS, um die Probe und verhindern Zusammenbruch von dünnwandigen Rohren während des Zentrifugationsverfahren zu verdünnen. Zentrifuge für 35 min bei 14000 · g, 4 ° C. Überstand dekantieren, halten Rohre auf den Kopf gestellt und auf ein Papiertuch legen. Warten 3 bis 5 min, bis das gesamte verbleibende Überstand wurde von der Probe in das Handtuch und dadurch entfernt getränkt wurde. Resuspendieren MV Pellet in 1000 ul PBS, Transfer in ein 1,5-ml-Röhrchen und Zentrifuge für 35 min bei 14.000 × g, 4 ° C in einer Tischzentrifuge. Überstand entfernen. Resuspendieren MV Pellet in 50 bis 500 & mgr; l PBS, abhängig von der Größe des Pellets. Alternativ lysieren MVs direkt, beispielsweise in RIPA – Puffer (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-Desoxycholat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)für die anschließende Western Blot-Analyse. Store MVs bei -20 ° C. Sie werden für mehrere Monate stabil bleiben, aber wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden. Optional: Bestimmen Sie die MV Proteinkonzentration mit einem Protein – Test (zB Bradford oder Lowry – Methode) , um MV Erträge zu beurteilen oder MVs für nachfolgende Experimente dosieren. Wenn zusätzliche Exos aus den Plasmaproben isoliert werden sind, dekantiert den Überstand aus Schritt 2.3 in eine Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 2 h bei 110.000 · g, 4 ° C. Den Überstand umfüllen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, resuspendieren Exo Pellet in 1000 ul PBS und Transfer in kleine (1,5 ml) Ultrazentrifugation Röhren. Ultrazentrifuge für 2 h bei 110.000 · g, 4 ° C, Überstand absaugen und Pellet resuspendieren Exo in 50-75 ul PBS oder RIPA-Puffer. 3. Charakterisierung der MVs durch Durchflusszytometrie Transfer 15 & mgr; l PBS + 1% Vesikel abgereicherte fötalem Kälberserum (FCS) in einer Durchflusszytometrie Röhre. HINWEIS: Vesicle abgereicherte FCS durch Zentrifugieren hitzeinaktiviertem (30 min bei 56 ° C) FCS für 18 Stunden bei 110.000 xg und Filtrieren des Überstand durch ein 0,2 – um – Filter hergestellt wird , wie zuvor beschrieben 24. In 5 ug (bei geringen Ausbeuten 3 ug sind auch anwendbar) von MVs in PBS. Inkubieren Proben für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungsstellen auf der Oberfläche MV zu blockieren und dadurch die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Fügen Sie einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das Protein von Interesse. Daraufhin wird die Menge an Antikörper für die Färbung verwendet vor zu verwenden, um die optimale Konzentration und garantieren ein niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu bestimmen. Stellen Sie sicher , auch ein Rohr mit ungefärbten MVs als negative Kontrolle und ein Rohr von MVs gefärbt mit dem passenden Isotyp – Kontrollantikörper bei der gleichen Konzentration (beispielsweise umfassen, wenn 1 ug Antikörper verwendet wird, auch verwendet werden 1 ug der Isotyp – Kontrolle eintibody) zu quantifizieren Hintergrundfärbung. HINWEIS: Es ist auch möglich, mehrfarbige Durchflusszytometrie an unterschiedliche Fluorochrome gekoppelt durch Zugabe von mehreren Antikörpern durchzuführen. Inkubieren für 20 min bei RT im Dunkeln. In 250 ul PBS und gehen Sie mit der Messung der Probe eines Durchflusszytometers verwenden. Im Falle, dass die Proben nicht sofort gemessen werden, mit 150 & mgr; l PBS und 50 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) zu fixieren Proben und lagern bei 4 ° C. ACHTUNG: PFA ist giftig. Verwenden Sie Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung. Reduzieren Sie die Schwelle des Durchflusszytometer auf den niedrigsten Wert möglich und für die MV Bevölkerung suchen eine Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Grundstück in logarithmischer Skala. Tor auf der MV Bevölkerung und zu bewerten das Fluoreszenzsignal in ein entsprechendes Histogramm. 4. Charakterisierung von MVs durch Western Blotting Resuspendieren MV Pellets direkt ineinem geeigneten Lyse – Puffer ( zum Beispiel RIPA – Puffer). Falls der MV – Pellet bereits in PBS resuspendiert worden, verdünnte es mindestens 1: 1 in einem geeigneten Lyse – Puffer ( zum Beispiel RIPA – Puffer). Bestimmung der Proteinkonzentration des MV Probe, beispielsweise durch Lowry – Assay. Vorbereitung 10 – 20 & mgr; g MVs in 22,5 & mgr; l RIPA-Puffer. Dann fügen Sie 7,5 ul 4x Laemmli-Ladepuffer und Wärme für 5 min bei 95 ° C. Belastungsproben auf einem Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und durchzuführen, und Immunoblotting nach Standardprotokollen. Nachdem die Proteine ​​auf die Membran übertragen, führen Sie den Standardprotokollen eine Ponceau-Färbung als Ladekontrolle nach. Entfärben Membran in TBST für 5 min bei RT. Block Membran für 30 min bis zu 1 h bei RT in 5% BSA in TBST. Inkubieren Membran mit dem primären Antikörper bei 4 ° C über Nacht oder für 2 h bei RT. Waschen Sie die Membran mit TBST 3 x 5 min. Inkubieren der Membran mit HRP-gekoppelten sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 in 5% BSA. Hinweis: Bei hohen Hintergrundsignalen, verwenden Milchpulver anstelle von BSA. Waschen Sie die Membran mit TBST 3x 5 min. Entwickeln Membran mit einem ECL-Nachweisreagens und Erfassungssignale auf Chemilumineszenz Filme oder einer Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. HINWEIS: Um MVs von Exos zu unterscheiden, Proteine wie Tubulin, actinin-4 oder mitofilin verwendet werden können , die in erster Linie sollte auf MVs 16,25 vorhanden sein. Darauf achten , dass die meisten tetraspanin Antikörper (zB CD9, CD81), das als Marker für Exos, nicht unter reduzierenden Bedingungen arbeiten und daher in nicht-reduzierenden Ladepuffer durch Erhitzen für 10 min bei 70 ° C hergestellt , gefolgt werden sollte.

Representative Results

Um die Ausbeute von MVs zu quantifizieren, die nach dem beschriebenen Protokoll isoliert werden können, wir die Menge der MVs isoliert aus Blutproben von 10 Spendern berechnet. Die MV – Ausbeute, die in einer Lowry – Proteinassay bewertet wurde, lag im Bereich von 10 bis 30 & mgr; g mit einem Mittelwert von 19,2 & mgr; g pro ml Blut MVs (Tabelle 1). Die Partikelkonzentration von Nanoteilchen Verfolgungsanalyse (NTA) bestimmt lag im Bereich von 1,66 x 10 9 bis 2,36 × 10 10 mit einem Mittelwert von 5,9 x 10 9 Partikeln pro ml Plasma – Probe (Tabelle 2). Weitere Charakterisierung der MVs durch Transmissionselektronenmikroskopie zeigten eine Population von Vesikeln mit einem Durchmesser von > 100 nm , das von einer Lipiddoppelschicht umgeben waren und enthielten keine Zellorganellen (1A). NTA bestätigt , dass die Größe der isolierten MVs von 100 bis 600 nm lag (1B) und die mittlere MV Größe betrug 201nm (Abbildung 1C). Das Anfärben für typische MV und Exo Marker durch Western Blotting gezeigt , dass die isolierten MVs für Tubulin – positiv waren und zeigte nur eine geringe Expression von CD9 und CD81, während Exos für Tubulin negativ waren und bereichert in CD9 und CD81 (Abbildung 2). Analyse der isolierten MVs mittels Durchflusszytometrie (3A) zeigte eine Vesikel Population definiert , die normalerweise für die MVs aus Zellkulturüberständen isoliert verwendet unter Verwendung der gleichen Parameter gated werden konnte , und das war deutlich verschieden von dem Hintergrundsignal , das durch die Messung von PBS erhalten + 1% Vesikel abgereicherte FCS ohne Zusatz von MVs (3B). Um die unterschiedlichen MV Populationen im Blut zu analysieren, MVs wurden für die verschiedenen Blutzellpopulationen mit etablierten Marker gefärbt, beispielsweise für CD62P platelet-derived MVs, CD45 für Leucocyten abgeleitetes MVs, CD235a fürroten Blutzellen stamm MVs und CD62E für endothelial cell-derived MVs (Abbildung 4). Diese Charakterisierung zeigte, dass der Anteil der MV Subpopulationen unter den untersuchten Spenderblutproben unterschieden, während die Mehrheit der MVs schien in allen Proben, die durch Blutplättchen vergossen werden. Abbildung 1: Größenverteilung von MVs aus dem peripheren Blut isoliert. A, Isoliert MVs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht . B, Representative Nanopartikels Verfolgungsanalyse (NTA) von MVs die Größenverteilung der Vesikel veranschaulicht. C, Die mittlere MV Größe von 10 unabhängigen Präparaten wurde von NTA (Mittelwert) gemessen. Bitte klicken Sie hier al anzuzeigenarger Version dieser Figur. Abbildung 2: Charakterisierung von isolierten MVs von Western Blotting. Differential-Protein-Expression auf den isolierten MVs und Exos von zwei Spendern wurde durch Western Blotting sichtbar gemacht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Analyse von MVs durch Durchflusszytometrie. A, MVs werden zunächst auf vorwärts (FSC) im Vergleich zu sidescatter (SSC) Plots Tor auf der jeweiligen MV Bevölkerung sichtbar gemacht . Anschließend werden diese MVs für das Antigen von Interesse, gekennzeichnet durch unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen das Antigen gerichtet sind. B Typische FSC gegen SSC – Plots für aus dem Plasma von zwei Spendern isoliert MVs. Als Vergleich wurde eine typische Kurve für die Tumorzellen stamm MVs von A549 Lungenkrebszellen, isoliert aus Zellkulturüberstand sowie eine negative Kontrolle unter Verwendung von nur PBS + 1% bläschen abgereichertem FCS ohne MVs sind auf der rechten Seite angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Charakterisierung von isolierten MVs durch Durchflusszytometrie. MVs aus drei Spendern wurden für die Expression von etablierten Blutzellmarker (rot) durch Durchflusszytometrie charakterisiert. Die jeweiligen Isotypkontrollen sind grau dargestellt.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Sample MVs / ml Blut [ug] # 1 29.4 # 2 10.3 #3 15.2 # 4 31.1 # 5 18.8 # 6 22.7 # 7 19.1 # 8 18,7 # 9 15,0 # 10 11.9 Tabelle 1: MV Proteinausbeute aus peripheren Blutproben. </strOng> Dargestellt ist die Menge der MVs pro ml peripherem Blut, das von Spendern 10 gezogen wurde. MV Ausbeuten wurden durch Lowry-Assay quantifiziert. Sample MVs / ml Plasma [Partikelanzahl] # 1 6.42E + 09 # 2 2.36E + 10 #3 1.88E + 09 # 4 6.51E + 09 # 5 3.48E + 09 # 6 4.57E + 09 # 7 2.09E + 09 # 8 1.66E + 09 # 9 2.54E + 09 # 10 6.20E + 09 Tabelle 2: MV Teilchenausbeute von peripheren Blutproben. </strong> MV wurden aus Plasmaproben von 10 Spendern und Partikelzählungen getrennt durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt wurden. Dargestellt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Messungen.

Discussion

Jüngste Studien auf EVs im Blut haben gezeigt, dass EV Zusammensetzung und zählt während der Ursache verschiedener Krankheiten verändern. Daher sind die Analyse und die weitere Charakterisierung dieser EVs von großem Interesse, um ihre mögliche Verwendung als Krankheits Biomarker für die Diagnose und Prognose beurteilen oder Therapie Antworten zu bewerten. Das Protokoll wir hier präsentieren, erlaubt die Isolierung der Vesikel mit einem Durchmesser von bis zu 600 nm, die keine Zellorganellen enthalten. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der aktuellen Definition von MVs und schließen die Anwesenheit von apoptotischen Körpern 2. Mit Western Blotting, konnten wir zeigen, dass die isolierten MVs zeigen eine hohe Expression von Tubulin, während die Tetraspaninen CD9 und CD81, die oft als Exo-Marker verwendet werden, wurden nur leicht ausgedrückt. Dies bestätigt , dass MVs von Exos unterscheiden und passt zu den letzten in eingehende Charakterisierung und Vergleich der beiden EV Populationen von Proteomik 25.

Inhalt "> Bei der Erfassung von Blutproben, ist es wichtig, die Zeit zwischen der Blutabnahme und Plasmapräparat so kurz wie möglich zu halten, um MV Abbau zu verhindern. Darüber hinaus längerer Lagerung von Blutproben zur Aktivierung von Blutzellen führen könnte verbessert MV verursachen Ein weiterer wichtiger Aspekt für MV Isolations Shedding und schließlich Apoptose, die in der Veröffentlichung von apoptotischen Körpern führt. ist Kontaminationen von MV Präparationen mit Plasmaproteinen oder kleiner Exos zu verhindern. Daher ist es wichtig, so viel von der Überstand wie möglich zu entfernen, nachdem Abzentrifugieren die MVs bei 14000 x g. Da das Pellet normalerweise sichtbar ist und dicht an der Wand des Rohres befestigt ist, kann der Überstand leicht mit einer Pipettenspitze entfernt werden. im Gegensatz zu Exos die Aggregate durch Ultrazentrifugation hoher Geschwindigkeit während der Herstellung zu bilden tendieren, und oft schwer zu suspendieren, tritt dieses Problem nicht mit MVs.

Unsere Studie zeigt, dass es mög istble MV Subpopulationen im Blut mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Obwohl die Nachweisgrenze der meisten Durchflusszytometer um 200 – 300 nm, wurden MVs reproduzierbar in Spender gemessen sowie Zellkulturproben mit den gleichen Parametern der Analyse und Tore, die klar ihre Unterscheidung von Hintergrundsignalen erlaubt. Es ist wichtig , vor den Messungen überprüfen, ob der PBS für die Analysen verwendet keine verunreinigenden Partikel enthalten , die einen hohen Hintergrund während Durchflusszytometrie (Abbildung 3) verursachen könnte. Obwohl einige kleinere MVs möglicherweise nicht in einer durchflusszytometrischen Ansatz eingefangen werden, entdeckten wir MVs aller großen Blutzellpopulationen (beispielsweise Blutplättchen, rote Blutkörperchen, Leukozyten, Endothelzellen). In unseren Analysen haben wir Standard – Marker für die verschiedenen Blutzellen , die zuvor auf MVs gefunden wurden , 26-29. Es sollte beachtet werden, dass Cytometrie, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen durch Strömungs, ter Menge und Konzentration aller Antikörper sollte auf einem MV Probe, die das Antigen von Interesse exprimieren, titriert werden. Wenn bestimmte MV Subpopulationen im Blut wird mit einer höheren Spezifität identifiziert werden, ist es möglich , Doppelfärbung gegen zwei verschiedene Antigene auf den jeweiligen MVs auszuführen und nur alle doppelt positiven MVs betrachten für nachfolgende 23 analysiert. Derzeit gibt es Bemühungen um eine Standardstrecke der MV – Subpopulationen im Blut von gesunden Personen 23.30 zu definieren. Diese Studien haben bereits gezeigt, dass platelet-derived MVs die größte Bevölkerung der MVs im Blut bilden, die in Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen ist.

Ein Vorteil der Durchflußzytometrie MV Proben zu charakterisieren, ist, daß dieses Verfahren bereits gut für diagnostische Zwecke etablierten in den meisten klinischen Zentren, die die mögliche Verwendung von MVs als Biomarker in klinischen Alltag Diagnose erlauben würden. Frühere Studien über EVs in Blut, das hauptsächlich Fokus habened auf kleineren Exos, verlassen sich auf entweder spezifischen Sortierverfahren selektiv eine zeitaufwendige (2 Tage) Isolationsverfahren mit Kopplung von Exos die gewünschte Exo Zielpopulation 31,32 oder benötigen zu analysieren 18 Perlen vor der Analyse zu Latex. Unsere eigene nicht veröffentlichte Beobachtungen legen nahe, dass die Durchflusszytometrie-Analyse von MVs aus Vollblutpräparaten ermöglicht auch die Erkennung von MVs wie tumorabgeleiteten MVs ohne solche Auswahlprozesse.

Zusammengenommen stellte das Protokoll hier ermöglicht die schnelle Isolierung von MVs aus peripheren Blutproben mit Standard-Laborgeräte und deren anschließende Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und Western Blot. Der gesamte Prozess kann in etwa 2 h durchgeführt werden, die künftige Studien über MV Profile in dem Blut des Patienten erleichtern, die erforderlich sind, das Potenzial von MVs als Krankheit Biomarker zu beurteilen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Materials

butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56°C)
filter 0.22µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

Tags

MicrovesiclesPeripheral BloodPlasmaCentrifugationFlow CytometryCharacterizationProtein ConcentrationProinvasiveMetastasisTumor PatientsEDTAPBSFCSAntibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image