דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית
Summary
We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
Abstract
ברוב היונקים, ossicles השמיעה באוזן התיכונה, כולל "פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת, הם העצמות הקטנות ביותר. בעכברים, מבנה גרמי שנקרא בולת שמיעת בתי ossicles, ואילו הקפסולה השמיעה המקיפה את האוזן הפנימית, כלומר השבלול ותעלות בצורת חצי עיגול. ossicles Murine חיוניים לדיון ובכך עניין רב החוקרים בתחום אף אוזן גרון, אבל חילוף החומרים, פיתוח, וההתפתחות שלהם רלוונטיות מאוד בתחומים אחרים. מטבוליזם העצם שינה יכול להשפיע על תפקוד שמיעה בעכברים בוגרים, ועכברי גן מחסר שונים להראות שינויי morphogenesis של ossicles שמיעה ברחם. למרות ossicles שמיעה בעכברים הם זעירים, המניפולציה שלהם אינה ריאלית אם אחד מבין אורינטציה אנטומיים שלהם ומבנה 3D. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את הבולה השמיעתית הקפסולה של עכברים לאחר לידה ולאחר מכן לבודד ossicles פרט על ידי הסרת חלק הבולה. אנו גם לדון כיצד emבולה ואת הקפסולה המיטה נטיות שונות כדי ליצור פרפין או חלקים קפואים מתאים להכנת סעיפים אורכים, אופקיים, או חזיתיים של "פטיש. לבסוף, אנו למנות הבדלים אנטומיים בין עכבר ossicles שמיעה האנושי. שיטות אלו תהיינה שימושיות בניתוח היבטים פתולוגיים, התפתחותיים האבולוציונית של ossicles שמיעתי באוזן התיכונה בעכברים.
Introduction
השלושה ossicles השמיעה של האוזן התיכונה, כלומר "פטיש, incus, ו מִשׁוֶרֶת, יוצרת שרשרת שמיעה יונקת ספציפית המשדר צלילים מן התוף אל האוזן הפנימית, או שבלול 1,2. פונקציה שמיעה ניתן להעריכם עכברים על ידי מדידת בדיקת ABR (ABR) ספי 3-6, ורעידות של "פטיש מאחורי עור התוף ניתן לנטר באמצעות לייזר דופלר Vibrometry (LDV) 7. על ידי שילוב של ABR, LDV, ועיוות מוצרי Otoacoustic הפליטה (DPOAE) מדידות, אובדן שמיעת מוליך יכול להיות מופלה מירידה חושית-8.
במודלים של בעלי חיים בתנאי אוזן הנדרשים, בשים לב לחשיבות של שמיעת בריאות מאוזנת לרווחתם של חולים בכל הגילים. לדוגמא, דלקת אוזן תיכונה היא דלקת אוזניים נפוצה מאוד לראות תינוקות אנושיים וילדים, וחמור, דלקת אוזן תיכונה חריפה וסיבוכיה יכולים להתרחש אם קונדיtion אינה מטופלת עם antimicrobials 9 המתאים. מודלי עכבר של דלקת אוזן תיכונה יכולים להיות שימושיים בהבנת המחלה ו בפיתוח טיפולים 10,11.
Ossicles Murine, אשר (למעט חלק goniale של "פטיש) נוצרים על ידי התאבנות endochondral 12,13, רלוונטי מאוד בחקר מטבוליזם ומורפוגנזה עצם. ראשית, גודלם הקטן מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של עצמות עם periosteum שלם באמצעות רנטגן או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 14. שנית, עצם מטבוליות סוטה, כגון ספיגת עצם מוגזמת או חסרה, או אינטראקציות נפגעות בין תאי עצם 15, ניתן לנתח כתורם פוטנציאלי לשמוע 3,4,7 פסד. Morphogenesis ossicle שלישית, חריגה מדווח בכמה עכברים הגן מחסר, כגון בעלי חיים ללא Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, 23 Prrx1, Goosecoid(GSC) 24,25, 13 Bapx1, 26 Tshz1, Dusp6 (Mkp3) 27, שהגולגולת (נוג) 28, 29 Fgfr1, קולטני הורמון בלוטת התריס (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 ואחרים 1,31, או בעכברים overexpressing Hoxa2 32. לבסוף, למרות גודלם הקטן, מבנים הקשורים ossicles כגון שרירים ומפרקים 33 34,35 נגישים.
ossicles העכבר הם קטנים יותר מאשר ossicles אדם, אך ראוי לציין כי אוזן העכבר האמצעית אינה גרסה מיניאטורית של מקבילו האנושי שלה. לדוגמא, בעכברים, עורק stapedial, אשר עובר דרך הטבעת של מִשׁוֶרֶת, נמשך לאורך כל חיים 36, ואילו אצל בני אדם, עורק stapedial העוברי נעלם במהלך הריון. בנוסף, את המורפולוגיה של "פטיש העכבר שונה מזו של הדואר עצמות אדם (ראה איור 6). בעכברים, הבולה השמיעתית (תוף) המקיפה את חלל האוזן התיכון מלא האוויר, ואילו בבני אדם, תאי אוויר פטמו מורכב עצם trabecular בתוך עצם הטמפורלית בתי ossicles ולא בולה 37. בשני המינים, הקפסולה השמיעה (קפסולה otic, מבוך גרמי) סוגרת שבלול ותעלות חצי עגולות של האוזן הפנימית. ביולוגיה השוואתית האבולוציונית של האוזן התיכונה נבדקה בהרחבה 38-40.
פרוטוקול להלן הראשון מתאר כיצד לנתח את הבולה ואת הקפסולה השמיעה, אשר מורכב בעיקר של האוזן התיכונה והאוזן הפנימית, בהתאמה. פרוטוקול זה גם מדגים כיצד לבודד את "פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת מן בולה השמיעה. לבסוף, הוא מראה כיצד לכוון את הבולה השמיעתית הקפסולה להטבעה כהכנת חתך רקמות של ossicles שמיעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לבודד את הבולה ואת הקפסולה שמיעה בעכברים לאחר לידה. לפני P12, רקמות שבירות ויכולות להינזק במהלך בידוד. לאחר P12, הבולה ואת הקפסולה השמיעה ניתן לבודד בקלות הרקמות הסובבות. ביתור בולה מהראש לפני החתך יש מספר יתרונות. ראשית, cavitation לאחר הלידה והצמיחה של בולה השמיעה להתרחש באופן פעיל ביותר מ P6 ואילך הושלמו על ידי P14 50. רקמת mesenchymal בין עור התוף וקיר שבלול מוחלף אוויר בתהליך cavitation. האוויר כתוצאה בחלל האוזן התיכונה יכול לעכב קשר בין רקמות ונוזלים במהלך קיבעון, decalcification והטבעה. זה קל יותר להסיר אוויר מן בולה השמיעה מבודד על ידי ניתוק (תהליך דְמוּי חֶרֶט) הקצה הקדמי במקום לנסות לעשות זאת הבולה unisolated. שנית, הכיוון של "פטיש (ועם עור התוף) הוא לא אנכיבראש. לכן קל לבתר את "פטיש במטוסים הרצוי על ידי טבעת הבולה ואת הקפסולה שמיעה המבודדות אורינטציה נתונה.
לאחר מבודד, בולה שמיעתית קפסולות שימושיות עבור ניתוחים רבים. לדוגמה, X-ray ברזולוציה גבוהה מיקרו-CT יכול לחשוף מורפולוגיה מיקרו העצם כגון נימים osteogenic ב "פטיש 14. מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence הוא כלי רב עוצמה כדי להמחיש מבנים בהערכת עכברים הכתב להביע חלבוני ניאון באוזן התיכונה או הפנימית 33. בנוסף, שונה in vivo או vivo לשעבר שיטות תיוג קרינה וזיהוי immunofluorescence הר שלם יכול להתבצע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור הוא גם שימושי עבור ניתוח תלת ממדי 51. למרות שלא תואר כאן, מבנים אנטומיים מגוונים קשורים הבולה ואת הקפסולה השמיעה כגון עצבים היקפיים, כלי דם, ואתעור התוף באוזן התיכונה גם ניתן להעריך באמצעות פרוטוקול זה.
שים לב חתך פרפין דורש decalcification של רקמות עצם לפני ההטבעה ולכן אינו מאפשר ניתוח של מינרליזציה. לעומת זאת, שיטת סרט קאוואמוטו 43 המשמשת להכנת חלקים קפואים יכולה להתבצע ללא decalcification והוא מתאים מחקרים מינרליזציה באמצעות טכניקות עצם תיוג vivo או צביעה מיוחדת כגון מכתים Alizarin. תנאי קריו חתך צריכים להיות מותאמים בהתאם על בסיס גיל עכבר. לדוגמה, טמפרטורה קרירה פחות בתוך החדר cryostat מומלצת דגימות עכבר מבוגר כדי למזער את הנזק סעיפים.
בשנת עכבר, המונח הנכון עבור הבליטה חצי כדורי הבולטים של "פטיש הוא "apophysis והמעוגל". עם זאת, המונח "brevis processus" כבר בשימוש נרחב כדי לציין את apophysis והמעוגל עבור ה יותרלעשרים שנים, במיוחד בקרב ביולוגי התפתחותיים עכבר 16,20,22-25. "Processus brevis" במקור התייחס לתהליך לרוחב (processus lateralis), שונה מן apophysis והמעוגל. אצל בני אדם, מהלך רוחבי דומת הקרנת חרוטים קלה מהווה את הקו הכללי של התקשרות אל עור התוף, המשתרע manubrium (לא לראות באיור 6B, נוף המדיאלי). בעכברים, בתהליך לרוחב הוא גם השלכה של manubrium בקצה השני אל umbo 48. שהחלקי flaccida של עור התוף הוא מעל המהלך הרוחבי של "פטיש. apophysis והמעוגל אינו ניכר "פטיש האדם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
| Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
| 14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
| Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
| Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
| Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
| Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
| Marking Pin | Various | ||
| Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
| Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
| TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
| Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
| Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
| Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
| Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
| Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
| Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
| NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
| KCl | wako | 285-14 | for PBS |
| Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
| KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
| Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
| EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
| Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
| Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
| Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
| Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
| Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
| Eosin | wako | 051-06515 |
References
- Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
- Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
- Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
- Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
- Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
- Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
- Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
- Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
- Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease?. N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
- Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
- Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
- Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
- Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
- Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
- Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
- Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
- Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
- O’Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
- Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
- Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
- Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
- Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
- Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
- Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
- Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
- Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
- Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
- Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
- Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
- Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
- Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
- Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
- Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. 22, 419-432 (2012).
- Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
- Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
- Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
- Henson, O. W., Keidel, W. D., Neff, W. D. Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), 39-110 (1974).
- . . Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , (2003).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kampen, P. N. V. . Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, 321-722 (1905).
- Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
- Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
- Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
- Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
- Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
- Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).
