Denne protokollen beskriver en robust, reproduserbar og enkel metode for isolering og kultur av myoblast stamceller fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker. De musklene som brukes her inkluderer fot og leggmusklene. Denne tilnærmingen muliggjør isoleringen av en anriket populasjon av primære myoblaster for funksjonelle studier.
Skjelettmuskulatur homeostase avhengig av muskelvekst (hypertrofi), atrofi og regenerering. Under aldring og i flere sykdommer oppstår muskelsvinn. Tap av muskelmasse og funksjon er assosiert med muskelfibertype atrofi, fibertype, defekte muskelregenerasjonenen forbundet med dysfunksjon av satellittceller, muskel stamceller og andre patofysiologiske prosesser. Disse endringene er knyttet til endringer i intracellulær samt lokale og systemiske nisjer. I tillegg til de vanlig anvendte gnagermodeller på muskel aldring, er det behov for å studere muskel homeostase og sløse med humane modeller, som på grunn av etiske implikasjoner, består hovedsakelig av in vitro kulturer. Til tross for den utstrakte bruken av menneskelige myogenisk stamceller (MPCS) og primær myoblasts i myogenesen, det er begrensede data på bruk av humane primære myoblast og myotube kulturer for å studere molekylære mekanismer som regulerer ulike sider av aldersrelatert muscle sløse, hjelpe til validering av mekanismer for aldring foreslått i gnager muskel. Bruken av menneskelige MPCS, primær myoblasts og myotubes isolert fra voksne og eldre mennesker, gir en fysiologisk relevant modell av molekylære mekanismer av prosesser knyttet til muskelvekst, atrofi og regenerering. Her beskriver vi i detalj en robust, billig, reproduserbar og effektiv protokoll for isolering og vedlikehold av humane MPCS og deres avkom – myoblaster og myotubes fra menneskelige muskelprøver ved enzymatisk oppslutning. Videre har vi bestemt passasjen nummeret som primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker gjennomgå senescence i en in vitro kultur. Til slutt viser vi muligheten til å transfektere disse myoblaster og evnen til å karakterisere deres proliferative og differensiering kapasitet og foreslår at de er egnet for å utføre funksjonelle studier av molekylære mekanismer for myogenese og muskelsvinn in vitro. </p>
Sykdoms- og aldersrelatert progressivt tap av skjelettmuskelmasse og funksjon resultater i skrøpelighet, nedgang i styrke og reduksjon i livskvaliteten for eldre mennesker. Skjelettmuskulatur står for omtrent 40% body mass 1. Under aldring og sykdom, progressiv atrofi av individuelle myofibers og reduksjon av muskel kvalitet på grunn av infiltrasjon av fett og fibrose forekommer 1, 2, 3, 4, 5, 6. Nylig er det blitt foreslått at artsspesifikke forskjeller i aldring av skjelettmuskulatur oppstår, nemlig at muskelfibertapet som forekommer i gnagere, ikke kan forekomme hos mennesker 7. Likevel er de gjenværende muskelfibre av alderen pattedyr preget av økt mottakelighet for skade og nedsatt regenerering <supclass = "xref"> 8. Voksen muskel reparasjon og vedlikehold formidles av satellitten celler 9, 10. Ved muskelskader og andre relevante stikkord, satellitt celler blir aktivert og sprer. En undergruppe av celler som vender tilbake til hviletilstanden og resten utvikler seg inn i myoblaster (myogenisk progenitorceller – MPCS). Disse bidrar til å reparere den eksisterende myofiber 11. Funksjonaliteten av satellitten celler avgjør suksessen til muskel regenerasjon og endringene i satellitt-celle tilgjengelighet med aldring er påvist 12, 13, 14, 15. Videre har satellitt celler fra muskelen av gamle mennesker og gnagere viser en transkripsjonen profil bryter og redusert regenerative potensialet 16, 17, </sup> 18, 19. Satellittceller av muskel fra gamle mus og mennesker har også vist seg å gjennomgå senescence resulterer i deres redusert funksjonalitet 20.
Den mest etablert cellelinje som muliggjør studium av muskel homeostase er murine cellelinje C2C12 21. En betydelig mengde studier har også benyttet murine primære myoblaster 22. Disse kulturene har ført til en betydelig forståelse av muse og virveldyr myogenesen samt muskel regenerasjon, myotube / myofiber atrofi, og hypertrofi prosesser som skjer i løpet av muskel sykdom og aldring 23, 24, 25, 26. Mer nylig har flere grupper beskrevet ved hjelp av humane primære myoblasts å studere myogenesen og muskel aldring. Men det er mangel på enighet med regards til forskjellene mellom primær myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker 27, 28, 29, 30, 31. Til tross for forskjeller karakterisert ved den systemiske og lokale miljø som oppstår under utvikling, aldring og sykdom 6, 32, 33, 34, in vitro myoblast og myotube kulturer forblir de mest tilgjengelige verktøy for å studere molekylære mekanismer forbundet med muskelutvikling, vekst og atrofi. I tillegg er disse studiene gir ikke bare en robust, men også en forholdsvis rask, billig og med høy gjennomstrømning in vitro verktøyet. Videre etiske implikasjoner knyttet til studier av menneskelige muskler betyr at for funksjonelle eksperimenter som involverer manipulering av genekspresjon <em>, In vitro menneskelige myoblast og myotube kulturer forblir det eneste alternativet tilgjengelig for virveldyr modellorganismer.
Her viser vi en enkel forsøksprotokoll for robust, billig og reproduserbar isolering av primære myoblasts eller MPCS, fra muskel av voksne og eldre mennesker og beskrive standardiserte betingelser for in vitro kultur (figur 1). Som primærkulturer fra muskel inneholder vanligvis fibroblaster i tillegg til myoblasts, anbefaler vi en forhåndspålegg skritt med sikte på forbedret renhet og kvalitet av primære myoblasts. For å oppsummere, har vi etablert en protokoll som åpner for effektiv og reproduserbar isolasjon, kultur og funksjonelle studier av beriket og funksjonelle MPCS / primær myoblasts fra skjelettmuskulatur av voksne og eldre mennesker.
Her presenterer vi en enkel, robust, billig, reproduserbar og effektiv metode for å isolere muskelstamceller / primær myoblasts fra voksne og eldre mennesker fra extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller bortfører halluces muskler. Denne protokollen har som mål å tillate studier med humane primære myoblaster fra voksne og eldre mennesker, særlig når mer sofistikerte metoder, slik som FACS- eller MACS-sortering, er ikke mulig eller praktisk.
Isoleringsfremgangsmåten presentert i dette manuskriptet tar omtrent 2 timer. Under muskel isolering, ble muskelen vasket i 70% etanol for å unngå forurensning. Forut for enzymatisk dissosiasjon av muskelen, er det viktig å skjære muskelen i små, men synlige biter, og unngå celleskader fra for mye hakking. Fordøyelsen resultater i dissosiasjon av myofibers og utgivelsen av satellittceller og myogeniske forløper celler. I vårt tilfelle for ~ 20 mg av skjelettmuskulatur, en 60 mm20 cm (2) Petriskål var den mest hensiktsmessige overflateareal for innhøsting av cellene. Celler belagt på en større flate viste redusert spredning, mens cellene sådd ut på en mindre flate viste økt celledød og agglutinasjon.
Etter isolering, ble cellene dyrket og ekspandert på laminin-dekket platene. Bruken av ikke-belagte overflater tendens til å redusere suksess for isolasjon. Av denne grunn kan cellene bli høstet fortrinnsvis på et forhåndsbelagt overflate direkte etter isolering. Fibroblaster-anrikede kulturer vil dominere i stedet for myoblaster-avledede celler hvis cellene høstes på en ikke-belagt overflate direkte etter isolering. Bortsett fra laminin, kan bruk av andre cellefesting løsninger som Matrigel og kollagenbaserte reagenser anvendes. Belegningsløsninger kan omfatte vekstfaktorer og andre forbindelser som vil fremme cellevekst, men disse kan forandre cellens oppførsel, og derfor de eksperimentelle resultatene. IVår erfaring er 10 mikrogram / ml laminin optimal konsentrasjon og riktig belegg reagens for satellittceller og myoblast vedlegg og spredning som det mangler noen vekstfaktor eller andre utfyller. Videre er laminin naturlig tilstede i basal lamina, direkte knyttet til sarcolemma, som spiller en nøkkelfunksjon i satellitt-celle vedlegg og migrasjon gjennom skjelettmuskelfiber.
De tilskudd av kulturmedier kan også ha en negativ innvirkning på oppførselen til den primære myoblast. For eksempel vekstfaktorgrupper, slik som FGF eller IGF, har pleiotropiske virkninger på primærkulturer myoblast, med FGF-2 kontrollere både mitogen og programmert celledød respons 31. Det er derfor nødvendig å nøye kontrollere dyrkingsbetingelsene, særlig fordi forskjellene i oppførselen av primære myoblaster isolert fra muskel av voksne og eldre mennesker er svært sannsynlig å være på grunn av renheten of kulturer og sannsynligheten for fibroblaster overfyller myoblasts i kultur under langsiktig kulturer 35. Vi har benyttet en time pre-plating av cellene i løpet av den første splitte på en ikke-belagt overflate for å minske forurensning av kulturene med fibroblaster.
Metoden beskriver vi er egnet for å isolere myogeniske progenitorceller fra musklene i både voksne og eldre mennesker. Det isolerte celle består av en representant myogenisk populasjon av celler som vist med en høy prosentandel av myogeniske celler (myod uttrykk og myogeniske egenskaper visualisert ved MF20 immunfarging i figur 1 og 2) og kan bli brukt som en in vitro modell for funksjonelle studier av fremgangsmåter forbundet med muskel homeostase.
Tidligere studier har preget isolasjon og forskjeller i egenskaper, eller mangel på sådan, av humane primære myoblasts fravoksne og eldre mennesker 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Eksistensen av geriatrisk og / eller ikke-fungerende humane MPCS er blitt demonstrert 6, 20, 22. Imidlertid har ingen forskjell i oppførselen til nylig isolerte humane MPCS også blitt vist 27. Vår protokollen tillater for isolering av primære myoblaster som i det minste delvis beholder sin fenotype, for eksempel redusert proliferativ potensial eller senescens av primære myoblaster isolert fra muskel av eldre mennesker og tillater anvendelse av disseceller for funksjonelle studier av molekylære mekanismer for muskel homeostase under aldring 22.
Den primære myoblasts isolert ved hjelp av metoden beskrevet her kan brukes ikke bare for myogeniske differensiering studier, men også for å undersøke intracellulære endringer, for eksempel endringer i genuttrykk som forekommer i menneske myogeniske forløper celler under aldring. Men endringene som skjer i cellene under langvarig ex vivo kultur må vurderes når analysere fenotypiske og genotypiske endringer som skjer under aldring. Vi anbefaler at du bruker nylig isolerte celler for dette formålet.
Videre er det primære myoblast dyrkningsmetode som er beskrevet her gjør det mulig for ekspansjon og relativt langvarig kultur av humane primære myoblaster, slik at for robuste funksjonelle studier in vitro. Vi har tidligere vist at myogeniske stamceller isolert ved hjelp av vår metode kan brukes til både uttrykk profilering og fulione studier av prosesser knyttet til muskel aldring 22. Denne fremgangsmåte er også anvendelig til musklene i voksen og gamle gnagere og gir mulighet for isolering av en anriket kultur av myoblaster som kan benyttes for profilering genetiske og epigenetiske endringer under aldring og funksjonelle studier 22. Begrensningene ved denne metoden omfatter bruken av, til en viss grad, blandet populasjon av celler i stedet for en ren populasjon av satellitten celler, noe som kan oppnås ved bruk av mer sofistikerte publiserte metoder 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
Vi presenterer en forenklet, rimelig og reproduserbar protokoll for isolering av primære myoblasts celler fra voksne og eldremennesker. Vår erfaring er tilgjengelige, mer sofistikerte metoder for isolering og kultur av humane primære myoblasts (som MACS- eller FACS-sortert satellittceller) er ideelle for noen typer studier, for eksempel profilering transcriptomic eller proteomikk forandringer i cellene. Men disse fremgangsmåter er kostbare, krever i det minste noen grad av ekspertise, og kan vise seg å være vanskelig på grunn av den lave proliferative hastighet av rene primære myoblast kulturer og fibroblaster voksningen myoblaster.
Vi presenterer en reproduserbar protokoll som tillater enkel isolering og kultur av humane primære myoblaster for anvendelse ved funksjonelle studier. I tillegg foreslår vi bruk av laminin 42 og begrenset bruk av bFGF som nøkkelfaktorer for en vellykket kultur 44. Vi foreslår også å unngå stress generert ved sentrifugering når splitte cellene og en pre-plating trinnet ved første passering 45. For å oppsummere, vi haroptimalisert en effektiv protokoll for isolering og kultur av primære myoblaster / MPCS fra muskler av voksne og eldre mennesker, som er også anvendelig til musklene i gnagere og muliggjør ekspresjon og funksjonelle studier av muskel homeostase.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |