מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג'ל
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
אחת משאלות המפתח בהתפתחות צמח הבנה הוא כיצד תאים בודדים להתנהג במהלך התמיינות וצמיחת איברים. באופן אידיאלי, אירועים הסלולר, כמו דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון תאי, ניתן לראות את האור של הקשר רחב של הרקמה. מטרה זו מציבה אתגרים טכניים ודורשת התבוננות איבר שלמה עם מרחבית גבוהה וכן פתרון זמני על פרק הזמן ממושך, אשר עשוי לגרום לתופעות צילום רעילים. מאז צמחים להסתגל במהירות לשינויים סביבתיים, תנאי הגידול חייבים להיות תחת פיקוח הדוק. כדי לעשות הדמיה לטווח ארוך מבלי להפריע את המצב הפיזיולוגי של הצמח, שלושה דברים צריכים להיות מובטחים, 1) תנאי גידול בתא המדגם, 2) מדגם יציב גובר על פני תקופות זמן ארוכות, ו 3) ההדמיה עם לעוצמות אור נמוכות כדי למנוע מצבים צילום נזק הלא פיזיולוגי.
conditi גדל פיסיולוגיons בתא מיקרוסקופ הדגימה הם קריטיים עבור ניסויים לטווח ארוך. ישנם מספר של פרוטוקולים זמינים המתארות תאי גידול הדמיה עבור מיקרוסקופי confocal 1 – 3. עם זאת, מיקרוסקופיה confocal מציגה-עוצמת אור גבוהה למפעל, אשר יכול לגרום לתגובות של מצוקה נפשית ובדרך כלל מעכבת את הצמיחה 4. בנוסף, רוב המיקרוסקופים קונבנציונליים לאפשר מיקום אופקי בלבד של המדגם, אשר אינו אופטימלי עבור צמחים מאז הם מנסים לכוון את עצמם ולגדול לקראת וקטור כובד. במהלך עשר השנים האחרונות, מיקרוסקופ אור הגיליון התפתחה ככלי רב עצמה כדי ללכוד את הפיתוח של דגימות גדולות ברזולוציה הסלולר לפרקי זמן של עד כמה ימים 5 – 9. במיקרוסקופ אור הגיליון מאפשרת מיצוב הדגימה אנכית והוא משמש יותר ויותר במחקר צמח לומדת פיתוח שורש 10 – 21, נבדק לאחרונה על ידי ברt ו מייזל 22. רבים מן המחקרים שהוזכרו 10,13 – 18,21 היו אופטימיזציה וערכו במעבדה של ארנסט HK Stelzer העסיקה דרך מיוחדת המדגם גובר מאופיין גדל השורש על פני השטח של ג'ל 17. במחקרים אלה, מיקרוסקופ מחוייט שמש, שבו הצמח מוחזק מלמטה. לעומת זאת, הרוב המכריע של מיקרוסקופי אור גיליון רחב זמינים להחזיק מדגם מלמעלה. לפיכך, שיטת הכנה המסוימת הזה לא ניתן ליישם בקלות. השיטה המוצגת כאן מספקת פרוטוקול לשיטת ההרכבה והמבוססת על-פני שטח הרלוונטי עבור OpenSPIM 23, פלטפורמת גישה פתוחה על מנת ליישם השיפור מיקרוסקופי תאורת מטוס סלקטיבי (SPIM).
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפשר הדמיה לטווח הארוך של שורשי ארבידופסיס במיקרוסקופ OpenSPIM אור הגיליון. המטרה זו מושגת על ידי גידול צמחים זקוף על היםurface של ג'ל עם השורשים בתוך נוזל ואילו העלים להישאר באוויר. על מנת להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח, מערכת תאורה מחוייט מאירה את העלים אבל לא את השורשים (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
יש גיליון אור פלואורסצנטי מיקרוסקופיה היתרון הגדול לשלב phototoxicity נמוך ומהירות רכישה מהירה, אשר ניתן להשתמש בם כדי ללכוד כמויות גדולות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה תוך שמירה על המדגם במצב פיסיולוגי. הרזולוציה של מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להשוות לזה של מיקרוסקופ confocal 9. עם זאת, פיזור אור וקליטה מתרחשים לאורך שביל העירור ופליטה בנפרד ואת איכות התמונה הכוללת יכולה להיות נמוכה משמעותי בתוך רקמות אטומות לעומת פני השטח. כדי לעקוף סיבוך זה ניתן להשתמש את האפשרות לסובב את המדגם לאורך הציר האנכי ולבחון את הנפח זהה מכיוונים שונים. אבל זה לא תמיד יתרון, שורשים לרוחב למשל לצאת בצד אחד של השורש וההדמיה מאחור תוצאות איכות תמונה נמוכה מבלי להשיג מידע נוסף. עם זאת, הסיבוב יכול לשמש בעיקר כדי למקם את sample על הצד הטוב. ההסדר האופקי הקלסי של העדשות האובייקטיביות מאפשר דרכים חדשות של הרכבה מדגמת. צמחים ליהנות במצב אנכי. מוצג כאן, "על פני השטח של הג'ל" שיטת הרכבה יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה אחרות כגון הטבעת השורש הפנימית של ג'ל 24,25. 1) מערכת השורש נמצאת בקשר ישיר עם במדיום הנוזלי. תא המדגם מחובר למערכת זלוף אשר מספקת מדיום חדש ברציפות. זה יכול לשמש גם כדי להחליף את כל הנפח במהירות של החדר מדגם ליישם מדיה או תרופות שונות. 2) לפני לטעום צמחים כנים לגדול כפי שהם משמשים לגידול במעבדות. צמחים יכולים לבחור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ורק הצמחים הרצויים צריכים להיות מוכנים. 3) המפעל מועבר מצלחת פטרי לבעל המדגם בלי שנוגעים בו. ובכך הצמח יכול לפתח עוד יותר על ג'ל אותו הוא הלך וגדל על ב incubato הצמיחהr לחץ מכאני מצטמצמים למינימום. 4) ההשקפה על הדגימה אינה חסומה ו סטיות אופטיות הן מזעריות כי החלל בין המדגם לבין מטרת זיהוי מלא אך ורק עם מדיום ולא חומרים אחרים עם מדדי שבירה שונים.
על מנת לבצע הדמיה לטווח ארוך, מערכת תאורה צמח יש צורך להבטיח פעילות הפוטוסינתזה של הצמח. ברוב המעבדות הצמחים גדלים על ג'ל שקוף, כלומר השורשים נחשפים לאור. דבר זה עלול לגרום לתגובות שונות לסביבת העבודה גורם לשינויים ביוכימיה והתפתחותם 26,27. על מנת להקטין את כמות האור על מערכת השורשים, רדיד פלסטיק שחור שימש לכיסוי פני המים כמו גם מכסה מנייר אלומיניום שחור כיסה את תא המדגם. אור יכול להגיע עלי הצמח דרך החור המרכזי במכסה. במצב זה, אין עלייה קלה ברקע נצפתה, רומזתg כי כמות האור התועה מן הנוריות האדומות וכחולות הופחתה באופן משמעותי על ידי מסנן GFP וגישות ההצללה. זה אפשר לשמור את האור דולק במהלך רכישת תמונה מבלי להגדיל את רעשי רקע מצלמה.
בעל המדגם נועד להדפסת 3D. עם זאת, הבחירה של חומר חיונית כמו כמה פלסטיק שנבדקו היה לא 100% יציבים, וכתוצאה מכך סחיפה של המדגם. לכן, מומלץ להשתמש שרפים במקום או לבנות בעל מדגם ידי כרסום מוט פוליאתילן (PEP). בעת שימוש התקנת מיקרוסקופ גיליון אור עם מערכת תאורה דו צדדית בעל המדגם עלול להפריע אחד מדפי האור בהתאם לזווית הסיבוב. כדי להפחית את הלחץ המכני במהלך גורף את הצמח מהצלחת, להשתמש זווית שטוחה של מרית. הצמח יכול במהירות להתייבש וזרימת אוויר ניסיון בפעם הראשונה. נסה להימנע מכל טיוטת אוויר (תנועות מהירות, זרימת אוויר-תנאים), ווRK באין מפריע וחלק בעל מדגם לתוך טיפ 1,000 μL pipet בכל הזדמנות אפשרית. בתוך מיקרוסקופ, חשוב לא לטבול את הצמח כולו בנוזל ולשמור על עלים יבשים.
הטכניקה היא אידיאלית עבור הדמיה בשלבים מוקדמים של היווצרות שורש לרוחב. בעת ביצוע הדמיה לטווח ארוך של טיפים שורש בוגר אחד חייב לזכור כי השורשים ארבידופסיס לגדול עם 100-300 מיקרומטר / h במהירות מחוץ לשדה הראייה. יישום עתידי מאוד שימושי יכול להיות אלגוריתם מעקב אוטומטי, אשר יאפשר צמיחת קצה השורש הבא על פני פרק הזמן ממושך. היכולת לשלוט בתנאים סביבתיים כגון אור והרכב תזונתי של המדיום במהלך תהליך הרכישה מאפשרת חוקרת כיצד צמחים להסתגל לשינויים. שורש נמצא בקשר ישיר עם במדיום נוזלי, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליישם תרופות להפעיל ביטוי גנים כימית, למשל באמצעות dexamethasone מושרה 28 או β-ESTRadiol מערכת מושרה 29. עם זאת, זה לוקח זמן להחליף את כל נפח תא המדגם לשטוף את תרופה. ההתקנה עשויה להשתפר באמצעות מזעור ההיקף הקאמרי מדגם להאיץ חילופי בינוני. עם זאת, טכניקה זו יש פוטנציאל גדול. השילוב של הליך הרכבה, תנאי גידול סטנדרטיים רכישת התמונה העדינה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון מאפשר מחקרים ארוך טווח של התפתחות צמח עם רזולוציה גבוהה ברמה פיזיולוגית. זה יעזור לחוקרים לחקור מנגנונים בסיסיים של התפתחות צמח.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מתייאשים Fendrych לקריאה / צפייה ביקורתית סטפן Stadlbauer עבור ציוד אודיו. הודות חנות Miba המכונית ב IST אוסטריה עבור תרומתם OpenSPIM. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מתוכנית אנשים (Actions מארי קירי) של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק REA n ° [291,734] מועצת המחקר האירופית (ERC פרויקט-2011 -StG-20101109-PSDP).
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -. J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
