JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Published: January 02, 2017
doi:
10.3791/55039
,
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,University of Toronto, 2Centre for Innovation,Canadian Blood Services

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Получить разрешение на использование человеческих образцов по исследовательской этике платы / этическими комитетами, и получить подписанное согласие от всех доноров. ММА также может быть выполнена с использованием РВМС мышей таким же образом, как человеческий анализа, после получения одобрения использования животных по этике. ММА использует методы асептики культуры ткани. Примечание: см Рисунок 1. Примечание: Хотя мы рекомендуем применение биоизоляции шкафа 2-го уровня в процессе анализа для поддержания асептики, поскольку метод является лишь "краткосрочный" метод культуры, не хватает на самом деле времени для бактерий загрязнять анализа. Таким образом, если уровень 2 биоизоляции шкафа не существует, а не покупать один раз для этого анализа, анализ может быть выполнен за пределами биосдерживанию шкафа, на открытом стенде. Использование 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, тем не менее, это не вариант , и должен быть использован дляоптимальные результаты. 1. периферической крови мононуклеарных клеток Изоляция Получить всю кровь человека от здорового донора или пациента через венепункции с использованием vacutainers, содержащих кислотно-цитрат-декстрозы (ACD) антикоагулянт (желто-топ трубки). Примечание: цельную кровь можно хранить в ДСА при комнатной температуре (18-22 ° С) в течение до 36 ч , прежде чем перейти к следующему шагу 11. Как правило, 1-2 10-мл пробирки Vacutainer цельной крови достаточно для анализа. Развести цельной крови 1: 1 об / об в теплой полной среде RPMI (RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES и 0,01 мг / мл гентамицина). Изолировать одноядерные клетки периферической крови (МНПК) из разбавленных цельной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности, в соответствии с рекомендациями производителя (см перечень материалов). Слой разбавленную кровь очень медленно по градиенту плотности (подогревают до комнатной температуры, 18-22 ° C). Примечание: сведение к минимуму количества Mixiнг на границе раздела для оптимального разделения крови путем тщательного наслоения смесь крови по каплям способом или с помощью пипетки. Разрешить смесь крови медленно слой на поверхности верхней части градиента плотности, помещая наконечник пипетки близко к градиенту плотности и позволяя смеси крови стекать вниз по стороне трубки очень медленно. В зависимости от масштаба эксперимента, слоя 10 мл смеси крови на вершине 3 мл градиента плотности (в трубе 15 мл) или слой 35 мл смеси крови на вершине 15 мл градиента плотности (в 50 мл трубка). Как правило, 10 мл цельной крови дает 10 миллионов МНПК, с некоторыми донорами к донору вариации. Примечание: Очень важно, что нет никакого смешивания смеси крови с градиентом плотности. Смесь крови должен слой на поверхности градиент плотности и медленно подниматься, пока вся кровь не дойдет до верхней части градиента плотности. Центрифуга слоистую смесь при 700 мкг в течение 30 мин без тормозов. CENTRifuged смесь должна разделиться на 5 слоев (сверху вниз): плазма, охристые пальто (содержащие МНПК), градиент плотности материала, гранулоциты и RBCs. Удаляют большую часть плазмы и осторожно извлечь содержимое охристые пальто (РВМС) в новый 15-мл трубки с помощью пипетки Пастера и всасывания лампу. Примечание: Удаление слоя светлого сгустка крови эффективно осуществляется путем применения всасывания на пипетки Пастера, выполняя круговое движение вокруг внешней стороны слоя, с кончиком пипетки напротив трубки. Промыть Выделенную МНПК три раза рН 7,3 фосфатно-солевом буфере (PBS) путем центрифугирования при 350 х г в течение 10 мин (с полными тормозами) между промывками. Развести осадок МКПК в полной среде RPMI. В зависимости от размера гранул, 3-7 мл среды достаточна. Граф РВМС с использованием трипанового синего и гемоцитометра. Только рассчитывать те клетки, которые не осквернена трипановым синим. Reconstitutе РВМС до 1750000 клеток / мл в полной среде RPMI. Семенной 400 мкл (700000 клеток) в каждую лунку 8-камеры слайде. Инкубировать слайд в 37 ° C, полностью увлажненном инкубаторе тканевых культур (с добавлением 5% CO 2) в течение 1 часа , чтобы позволить моноциты / макрофаги придерживаться. 2. Предварительная обработка прилипших моноцитов Примечание: Этот шаг необходим только в том случае ищет пути ингибировать или усиливать фагоцитоз. Предварительная обработка придерживалась моноцитов с любым препаратом (ами) или соединением (ями), представляющих интерес. Развести препарат (ы) или другого исследуемого материала до нужной концентрации с использованием полной среды RPMI. Примечание: Например, 200 мкг / мл иммуноглобулин, как правило, используется для получения 95-100% ингибирование фагоцитоза при использовании человеческих моноцитов. Отберите и отбросить супернатант, содержащий любые не прилипшие клетки из 8-камеры слайде после 1-часовой инкубации (после стадии 1.6). Замените его на 400мкл лекарственного препарата или другого лечения и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С. При аспирационных и замене решения в 8-камеры слайде, убедитесь, чтобы контролировать поток флюидов, так что слабо прилипшие клетки не отрываться. Кроме того, работают только с 2-3 пустых лунок в то время, и избежать высыхания лунок. Примечание: Как правило, каждая обработка выполняется в технических трехкратном повторе. 3. Опсонизация из R 2 R 2 красных кровяных клеток Примечание: R 2 R 2 , используемый здесь, получены из коллекции Центра крови (Canadian Blood Services), но они также являются коммерчески доступными. Опсонированных R 2 R 2 Эритроциты используют в качестве положительного контроля для FcγR-опосредованного фагоцитоза. Наивные R 2 R 2 следует хранить в растворе Alsever ( в, чтобы продлить срок годности) при 4 ° С в течение 1 месяца. Решение Alsever выполнен в доме и состоит из 0,8% Вес / об тринатрийцитрата (дигидрат), 1,9% вес / об декстрозы, 0,42% вес / об хлорида натрия и 0,05% вес / об раствором лимонной кислоты (моногидрат). Если R 2 R 2 клетки отсутствуют, другие Резус-phenotyped клетки, такие как R 1 , R 2, R 1 , R 1, R 1 г, или R 2 г, могут быть использованы. Мытье R 2 R 2 (CDE / CDE) красных кровяных клеток в PBS в общей сложности три раза с помощью центрифугирования при 350 мкг в течение 5 минут каждый. Примечание: Количество эритроцитах, необходимых зависит от экспериментального размера и может быть снова рассчитанным. Всегда мыть избыточное количество эритроцитах, так как эритроциты теряются во время каждой стирки из-за лизиса или во время удаления надосадочной жидкости. Например, в эксперименте с 5 процедур и 2 управления, все проведенные в технических трехкратном повторе, имеется в общей сложности 21 скважины. 21 лунок с 400 мкл / лунку 1,25% смеси РБК указывает на то, что 105 мкл упакованной, опсонизированным необходимы РБК. 200 мкл RBC должен быть первоначально моют и 150 & #181, L должно быть опсонизированным чтобы гарантировать, что имеется достаточное количество эритроцитах на этапе фагоцитоза. Opsonize промытый R 2 R 2 лепешку смесью 1: 1 об / об поликлональные анти-D антител из сыворотки крови человека и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 ° С, с периодическим перемешиванием. Примечание: Если поликлональные анти-D антитела не доступны, можно использовать моноклональные анти-D-антитела, которые являются коммерчески доступными, или анти-D, который обычно используется для Rh иммунной профилактики, которая может быть получена из банков крови или переливания Сервисы. Тестирование Оптимизация должна проводиться в начале, при настройке анализа, и всякий раз, когда переключение много не-титровали поликлональных антител или переключение на моноклональное антитело. Это позволяет определить оптимальную концентрацию или объем анти-D, необходимого для теста антиглобулиновой (IAT) результат между 3+ и 4+ и в результате фагоцитоза между 70-90 фагоцитирующих эритроцитах на 100 моноцитов подсчитанных. Промыть opsonizeD R 2 R 2 в общей сложности три раза в PBS с помощью центрифугирования при 350 мкг в течение 5 минут каждый. Примечание: Успешное опсонизации R 2 R 2 может быть подтверждена путем осуществления непрямой IAT. Если коротко, то вторичные поликлональные анти-человеческие антитела добавляют для связывания первичных антител opsonizing на RBC поверхностях, и усиленный сигнал можно наблюдать в виде гемагглютинации. Подробный протокол производитель может быть найден в файле дополнительных материалов. Разведите промытый R 2 R 2 гранулы до 1,25% об / об с использованием полной среды RPMI. Примечание: Избыточный опсонированных R 2 R 2 могут быть сохранены в растворе Alsever в при 4 ° С в течение до недели. 4. Fc рецептор-опосредованного фагоцитоза Аспирируйте лекарственное средство или среда супернатант из 8-камеры слайд и добавить 400 мкл 1,25% об / об R 2 R 2 смеси. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч. в кормовой частиэр 2 ч инкубации, удалите камеры с помощью адаптеров производителя. Промокните избыток R 2 R 2 на бумажное полотенце. Убедитесь, что слайд не высыхает. Заполните 100-мл химический стакан с PBS. Погрузитесь и мыть слайд, медленно перемещая слайд вперед и назад (около 30-40 ходов) , чтобы удалить большую часть ун-фагоцитированы R 2 R 2. Удалить слайд из PBS. Промокните излишки PBS, используя бумажное полотенце или ткань и Высушите слайд. Закрепите высушенный на воздухе слайд в 100% метанола в течение 45 с. Затем, воздушно-сухой фиксированный слайд. Примечание: Слайды могут быть закреплены с помощью другого метода , который является более совместимым для окрашивания вниз по течению, такие как Грюнвальд-Гимза 21 или пятно Райт-Гимза 22. Установите слайд, используя в доме-производства elvanol гистологическая среда (или другой коммерчески доступный гистологическая среда) и добавить покровные. Примечание: Elvanol монтажная среда состоит из 15% вес / объем росмолы спирт lyvinyl и 30% об / об глицерине в PBS. Смесь нагревают до тех пор, вся смола не растворится и глицерин, гомогенно смешанным. Это может быть заменен другими коммерчески доступными монтажной средой. Разрешить монтирование высохнуть в течение ночи перед количественной оценки. 5. Количественное фагоцитоза С помощью фазово-контрастного микроскопа и 40X линзы объектива, вручную определить количество фагоцитирующих событий путем подсчета по меньшей мере , 200 моноциты и количество фагоцитирующих R 2 R 2 в пределах этих моноцитов. Иметь один счетчик в каждой руке , чтобы одновременно определить число моноцитов и число фагоцитированы R 2 R 2. Получите среднюю фагоцитарную индекс путем деления числа фагоцитирующих R 2 R 2 по количеству моноцитов и умножения на 100. Экспресс данные как среднее значение (среднее значение фагоцитарного индекса) ± стандартная ошибка среднего (SEM). </li>

Representative Results

Следуя важные шаги на рисунке 1 и процедуре , описанной выше, ММА может быть воспроизводимо выполняется. Иммуноглобулин был использован в качестве примера для ингибирования фагоцитоза на рисунке 2. Иммуноглобулин, как известно, связывает и блокирует рецепторы Fc, препятствуя таким образом вниз по течению исход фагоцитоза. Титрованием количество IVIG , используемый, наблюдается ингибирование в зависимости от дозы, в которой при концентрации выше 200 мкг / мл в результате близко к ингибированию 100% и концентрации ниже 0,5 мкг / мл не ингибирует у всех (фиг.2А). Когда индексы фагоцитирующих трансформируются и нормализованы к положительному управления R 2 R 2 , в качестве 0% ингибирования, ингибированного кривой с IC 50 3 мкг / мл может быть определена (Фигура 2В). В дополнение к выполнению анализа последовательно, quantificaние анализа иногда может быть затруднено. Рисунок 3 представляет собой совокупность фазово-контрастной микроскопии изображений различных горок ММА. С опытом микроскопии, можно отличить моноцитов от загрязняющего РБК (Рисунок 3D) или вакуоли из фагоцитированных RBC (рис 3B). Плотные скопления клеток и / или их остатков следует избегать во время количественной оценки (рис 3Е и F). Кроме того , следует избегать чрезмерного opsonizing на R 2 R 2 RBC, что привело бы к повышенному фагоцитоза , что overcrowds интерьер моноцитов и препятствует точной количественной оценки (рис 3C). Рисунок 1. Принципиальная схема ММА. Шаг за шагом изображение важнейших шагов в ММА: выделения РВМС из цельной крови, кормления, приклеенный monocytэс с опсонизированным R 2 R 2, и промывки камеры слайды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Внутривенный IgG (иммуноглобулин) ингибирует фагоцитоз в пробирке с использованием ММА. Иммуноглобулин, как известно, ингибирует фагоцитоз и используется в качестве контроля торможения в человеческом ММА. (А) Титрование ИГВВ привело к зависимому от дозы ингибирование фагоцитоза по сравнению с необработанным R 2 R 2 управления. Результаты показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) п = 3 экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием Стьюдента -TEST: ** P≤0.01 и *** P≤0.001. (B) Ингибирование кривая ВВИГ с IC 50 °F 3 мкг / мл (пунктирная линия). Результаты показывают данные нормализованы к необработанным R 2 R 2 (0% ингибирования); среднее значение ± SEM из N = 3 экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. фазово-контрастной микроскопии изображений образца слайдов под 40 – кратном увеличении. (A) Идеальный слайд , в котором моноциты фагоцитированы 1-2 R 2 R 2 в среднем (черные стрелки с характерным ореола свечения), с очень немногими, загрязняющего ун-фагоцитированных R 2 R 2 в фоновом режиме (белые стрелки). (B) Как показано на этом слайде, моноциты иногда имеют увеличенные вакуоли (белые стрелки), которые могут быть ошибочно приняты за фагоцитированы R 2 R 2. (C </ сильный>) Когда R 2 R 2 были более опсонизированным, более 4-5 фагоцитированы R 2 R 2 на моноциты (черные стрелки) делают точный подсчет трудно, так как R 2 R 2 переполнены в моноцитов и отдельной клетке границы нельзя отличить. (D) Недостаточная промывка слайде приводит к обильному R 2 R 2 загрязнения (белые стрелки), которые могут быть ошибочно приняты за прилипших эритроцитах. (Е) Иногда, моноциты и загрязняющие Эритроциты могут образовывать кластеры. Кластеры также указывают на бактериальное загрязнение, чего следует избегать. (F) Моноциты могут образовывать более крупные агрегаты, которые следует избегать во время количественной оценки. Используя случайный выбор полей для просмотра, панель А то, что обычно наблюдается, если ММА была выполнена должным образом. Шкала бар составляет 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.

Discussion

ММА является трудоемкая техника, которая требует специальных знаний как в тканевой культуре и микроскопии. Есть несколько важных шагов для обеспечения успеха: 1) генерация моноцитов монослоя; 2) опсонизация из эритроцитах, и 3) ручной Количественное. Моноцитов монослой не прилипает очень сильно к камере горкой, так что физиологический рН должно поддерживаться на протяжении всего теста 11 и достаточное количество МНПК должны быть посеяны. Энергичное пипеток, которые могли бы нарушить прилипшие клетки, следует избегать. Один из подходов, чтобы всегда удалять и добавлять решения из того же угла камеры и чтобы гарантировать, что движение происходит медленно и постепенно. Точно так же, в течение последней стадии промывки, чтобы удалить избыток RBCs, движение должно быть медленным и устойчивым. Это обеспечивает минимальное нарушение к монослоя при этом удаляя большую часть не-фагоцитированы эритроцитах. Недостаточная промывка приведет к высокому фоне загрязняющими эритроцитах, что делает ручной кваntification трудно. Во- вторых, R 2 R 2 Эритроциты должны быть достаточно опсонизированным для получения среднего фагоцитарный индекс 80-120 для управления фагоцитоза. Этот желаемый диапазон фагоцитарной баланс между простотой подсчета (например, моноциты с более чем 5 фагоцитированы Эритроциты трудно точно количественно) и поддержание достаточного количества фагоцитоза для статистического анализа. Степень опсонизация может быть подтверждена IAT, и чтение между 3+ до 4+ требуется. R 2 R 2 Эритроциты должны быть отброшены , если есть избыток лизиса во время стирки, когда надосадочную жидкость становится темно – красным, или когда значительное снижение фагоцитоза наблюдается в экспериментах , в связи со старением клеток при хранении. И, наконец, руководство Количественное с помощью микроскопа может быть сложно, особенно при сравнении между отсчеты персонала лаборатории и между экспериментами. Рассматривая ту же область на каждую лунку, или просто путем подсчета больше клеток, Более последовательным граф может быть получен. Бок о бок обучение с опытным специалистом и использование назначенного набора учебных слайдов рекомендуется.

Одним из основных критика ММА является субъективность ручной шага количественной оценки. Тем не менее, с надлежащей подготовки, последовательность может быть получена через различные счетчики. Другим ограничением является то внутренние различия доноров к-донора в моноцитов фагоцитарных способностей и в R уровней экспрессии антигена 2 поверхности 2 R, которая является источником изменения данных при работе с человеческими образцами.

Другие альтернативные методы доступны для изучения FcγR-опосредованный фагоцитоз. Большинство коммерческих наборов используют выход флюоресценции для мониторинга фагоцитоз (например, bioparticles, рН-чувствительный флуоресцентный белок, или IgG , меченные флуоресцентными латексные шарики). Использование флуоресцентного продукции делает предложение более объективной количественной оценки, но также необходимо конрим доступности, стоимости, а также обучение, связанное с использованием флуоресцентного микроскопа или проточного цитометра, а также последовавшей зависимости от коммерчески доступных наборов.

И, наконец, этот анализ может быть изменен в зависимости от вопроса исследования. Например, при тестировании ингибирования наркотиков фагоцитоза, моноциты могут либо быть предварительно обработаны или совместно инкубировали с обоими препаратами и опсонизированных эритроцитах (т.е. конкуренция анализ). Расположенный ниже по потоку передачи сигналов антител различных подтипов, химерные антитела или рекомбинантные конструкты также могут быть проверены. С недавних прорывов в разработке универсального антигена-нуль крови через 24, ММА может быть использован в начальных экранах этих антиген-нуль эритроцитах с различными антителами , чтобы оценить , существует ли действительно снижена эффективность в инициировании фагоцитоз.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services’ Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells  Canadian Blood Services Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) 
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A., et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Tags

Monocyte Monolayer AssayFc Receptor-mediated PhagocytosisImmunohematologyBlood TransfusionAuto-antibodiesAllo-antibodiesRed Blood CellsOpsonizationPolyclonal Anti-D AntibodiesPBMCDensity Gradient CentrifugationIn Vitro Functional Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image