JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Published: January 02, 2017
doi:
10.3791/55039
,
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,University of Toronto, 2Centre for Innovation,Canadian Blood Services

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

לקבל אישור לשימוש דגימות אנושיות על ידי ועדות האתיקה במחקר הלוח / מוסדיות, וליצור הסכמה חתומה מכל תורמי האדם. MMA יכול גם להתבצע באמצעות PBMCs העכבר באופן דומה כמו assay אדם, לאחר אישור אתיקה השימוש בבעלי חיים. MMA מנצל טכניקות בתרבית רקמה ספטית. הערה: ראה איור 1. הערה: למרות שאנו ממליצים שימוש ארון biocontainment רמת 2 במהלך assay לשמור טכניקה מזוהמת, כשיטה היא רק שיטת תרבות "לטווח קצר", אין באמת מספיק זמן לחיידקים לזהם את assay. לכן, אם ארון biocontainment רמה 2 אינה קיימת, ולא לקנות אחד רק עבור assay זה, assay יכול להתבצע מחוץ לארון biocontainment, על ספסל פתוח. השימוש 37 ° C חממה עם 5% CO 2, לעומת זאת, היא לא אופציה וחייב לשמשתוצאות אופטימליות. 1. בידוד תא הדם ההיקפי mononuclear השג דם אדם שלם מתורם בריא או חולה באמצעות venipuncture באמצעות vacutainers המכילים חומצה-ציטרט דקסטרוז (ACD) קרישה (צינורות צהוב-top). הערה: כל הדם ניתן לאחסן ACD בטמפרטורת החדר (18-22 מעלות צלזיוס) במשך עד 36 שעות לפני שתמשיך לשלב הבא 11. בדרך כלל, 1-2 10 מ"ל צינורות Vacutainer של דם מלא מספיקים עבור assay. לדלל את הדם כולו 1: 1 v / v במדיום חמים RPMI להשלים (RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 20 HEPES מ"מ, ו 0.01 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין). לבודד תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מהדם המדולל השלם באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות, כפי שהומלץ על ידי היצרן (ראה רשימה של חומרים). שכבה בדם מדולל מאוד לאט מעל שיפוע צפיפות (מחומם לטמפרטורת החדר, 18-22 מעלות צלזיוס). הערה: יקטין את כמות mixing על הממשק עבור ההפרדה האופטימלית של דם על ידי שכבות תערובת הדם בזהירות באופן dropwise או באמצעות פיפטה. אפשר תערובת הדם לשכבה לאט מעל מפל הצפיפויות ידי צבת קצה pipet הקרוב מפל הצפיפויות, בכך שהיא מאפשרת את תערובת הדם לרוץ במורד הצד של הצינור מאוד לאט. בהתאם בסולם של הניסוי, שכבת 10 מ"ל של תערובת דם על גבי 3 מ"ל של שיפוע צפיפות (בתוך שפופרת 15 מ"ל) או שכבת 35 מ"ל של תערובת דם על גבי 15 מ"ל של שיפוע צפיפות (בתוך 50 מ"ל צינור). בדרך כלל, 10 מיליליטר של דם מלא מניב 10 מיליון PBMCs, עם כמה הבדלים תורמים אל התורם. הערה: חשוב מאוד כי אין ערבוב של תערובת הדם עם שיפוע הצפיפות. תערובת הדם צריכה שכבה במשך מפל הצפיפויות לעלות לאט עד שכל הדם הוא על גבי שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה תערובת שכבתית ב 700 XG במשך 30 דקות ללא בלמים. centrתערובת ifuged צריך להפריד לתוך 5 שכבות (מלמעלה למטה): פלזמה, מעיל באפי (המכיל PBMCs), חומר שיפוע צפיפות, גרנולוציטים, ו RBCs. הסר וזורקים את רוב הפלזמה ובזהירות לאחזר את המעיל באפי תוכן (PBMC) לתוך צינור חדש 15 מ"ל בעזרת פיפטה פסטר נורה יניקה. הערה: הסרת שכבת מעיל באפי נעשה ביעילות על ידי יישום יניקה על פיפטה פסטר תוך ביצוע תנועה מעגלית סביב החלק החיצוני של השכבה, עם קצה פיפטה נגד הצינור. לשטוף שלוש פעמים PBMCs המבודד מלוחים pH 7.3 שנאגר פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות (עם בלמים מלאים) ב בין השוטף. מחדש גלולת PBMC במדיום RPMI מלא. בהתאם לגודל של הגלולה, 3-7 מיליליטר של מדיום מספיק. ספירת PBMC באמצעות trypan כחול ו hemocytometer. רק לספור אותם תאים שאינם מוכתמים על ידי trypan הכחול. Reconstitut.ה PBMCs כדי 1,750,000 תאים / מ"ל ​​במדיום RPMI מלאה. זרע 400 μL (700,000 תאים) לבאר כל שקופית 8-קאמרית. דגירה את השקופית תרבות חממה humidified 37 ° C רקמה, מלא (בתוספת 5% CO 2) עבור h 1 לאפשר מונוציטים / מאקרופאגים לדבוק. 2. טיפול מקדים של דבקה מונוציטים הערה: שלב זה הכרחי רק אם מחפשים דרכים לעכב או לשפר phagocytosis. טרום לטפל דבקה מונוציטים עם כל תרופה (ים) או תרכובת (ים) של עניין. לשקם את התרופה (ים) או חומר בדיקה אחר לריכוז הרצוי באמצעות מדיום RPMI להשלים. הערה: לדוגמה, 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​של IVIG משמש בדרך כלל כדי להניב עיכוב 95-100% של phagocytosis בעת שימוש מונוציטים האדם. לשאוב וזורקי supernatant המכיל את כל תאים שאינם חסידים משקופית 8 הקאמרי לאחר דגירת 1-ח (לאחר שלב 1.6). להחליף אותו עם 400μL של תרופה או טיפול אחר דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס. כאשר aspirating והחלפת פתרונות בשקופית 8-הקאמרית, הקפד לשלוט על זרימת הנוזלים כך תאים דבקים חלש לא להמריא. כמו כן, לעבוד עם רק 2-3 בארות ריקות בכל פעם למנוע התייבשות הבארות. הערה: בדרך כלל, כל טיפול מתבצע triplicates הטכנית. 3. Opsonization של R 2 כדוריות הדם האדומות R 2 הערה: R R 2 2 משמש כאן מתקבלת המרכז לאיסוף הדם (שירותי דם קנדיים), אבל הם גם זמינים מסחריים. RBCs R 2 R 2 Opsonized משמשים כביקורת חיובית עבור phagocytosis בתיווך FcγR. R 2 נאיבית R 2 יש לאחסן פתרון של Alsever (כדי להאריך את חיי המדף) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1. הפתרון של Alsever נעשה ללא צורך במיקור חוץ מורכב 0.8% W / ציטראט Trisodium נ (מימית), 1.9% w / דקסטרוז נ, 0.42% w / v נתרן כלורי, ו 0.05% w / v חומצת לימון (מונוהידראט). אם R 2 R 2 תאים אינם זמינים, תאים Rh-phenotyped אחרים, כגון R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 r, או R 2 R, ניתן להשתמש. לשטוף R 2 R 2 (CDE / CDE) כדוריות דם אדומות PBS בסך הכל שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ב XG 350 במשך 5 דקות כל אחד. הערה: כמות RBCs הצורך תלוי בגודל הניסיוני יכולה להיות גב מחושב. תמיד לשטוף סכום עודף של RBCs, מאז RBCs הם איבדו במהלך כל שטיפה בשל תמוגה או במהלך הסרת supernatant. לדוגמה, בניסוי עם 5 טיפולים 2 שולטת, כולם בשפה triplicates טכנית, יש בסך הכל 21 בארות. 21 בארות עם 400 μL / טוב של תערובת 1.25% RBC מציין כי 105 μL של ארז, opsonized RBC נדרשים. 200 μL של RBC יש לשטוף בתחילה 150 & #181; L צריך להיות opsonized על מנת להבטיח כי יש כמות מספקת של RBCs עבור השלב phagocytosis. Opsonize גלולה R 2 R 2 נשטף עם 1: 1 v / נוגדנים אנטי D polyclonal נ מ נסיוב אדם דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס, עם ערבוב לסירוגין. הערה: אם נוגדנים נגד D polyclonal אינם זמינים, ניתן להשתמש נוגדנים אנטי D חד שבטיים, אשר זמינים באופן מסחרי, או-D אנטי משמש בדרך כלל עבור טיפול מונע חיסוני Rh, אשר ניתן להשיג מבנקי דם או עירוי שירותים. בדיקות אופטימיזציה צריכה להתנהל בהתחלה, בעת הגדרת assay, ובכל פעם מיתוג המון נוגדנים polyclonal-titered האו"ם או מעבר נוגדן חד-שבטי. זאת על מנת לזהות את הריכוז או נפח האופטימלי של אנטי D דרוש לצורך בדיקת antiglobulin (IAT) תוצאה של בין 3+ ו 4+ וגם תוצאת phagocytosis של בין 70-90 RBCs phagocytosed ל -100 מונוציטים נספרו. שטפו את opsonizeR ד 2 R 2 בסך הכל שלוש פעמים PBS באמצעות צנטריפוגה ב XG 350 במשך 5 דקות כל אחד. הערה: מוצלח opsonization של R 2 R 2 יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע IAT עקיף. בקצרה, נוגדנים אנטי אנושיים polyclonal משני מתווספים לאגד נוגדני opsonizing עיקריים על משטחי RBC, ואת האות המוגבר ניתן להבחין בצורת hemagglutination. פרוטוקול יצרן מפורט ניתן למצוא בקובץ חומרים המשלים. מחדש גלולת R 2 R 2 שטף ל -1.25% v / v באמצעות מדיום RPMI להשלים. הערה: R opsonized העודף 2 R 2 ניתן לאחסן הפתרון של Alsever ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. 4. Fc קולטן בתיווך Phagocytosis לשאוב את התרופה או supernatant בינוני משקופית 8 קאמרית ולהוסיף 400 μL של התערובת 1.25% v / v R 2 R 2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. אָחוֹראה 2 שעות של דגירה, להסיר את התאים באמצעות המתאמים של היצרן. טובלים את R R 2 עודף 2 על מגבת נייר. ודא כי את השקופית לא להתייבש. ממלאים כוס 100 מ"ל עם PBS. לצלול ולשטוף את השקופית על ידי העברת השקופית לאט קדימה ואחורה (סביב 30-40 משיכות) כדי להסיר את רוב R un-phagocytosed R 2 2. להסיר את השקופית מן PBS. טובלים את PBS עודף באמצעות מגבת נייר או רקמות ואוויר-לייבש את השקופיות. תקן את השקופית אוויר יבש מתנול 100% במשך 45 שניות. לאחר מכן, אוויר יבש השקופית הקבועה. הערה: שקופיות ניתן קבוע בשיטה אחרת כי היא תואמת יותר עבור מכתים במורד הזרם, כמו כתם גרונוולד-Giemsa 21 או רייט Giemsa כתם 22. הר השקופיות באמצעות הרכבה בינונית ללא צורך במיקור חוץ מתוצרת elvanol (או אחר בינוני הרכבה זמין מסחרי) ולהוסיף coverslips. הערה: הרכבה בינונית Elvanol מורכב 15% w / v polyvinyl שרף אלכוהול 30% גליצרין v / v ב PBS. התערובת מחוממת עד שכל השרף נמס ואת גליצרין הוא מעורב homogenously. זה יכול להיות מוחלף עם מדיום גובר זמין מסחרי אחר. אפשר בהר לייבוש למשך הלילה לפני כימות. 5. כימות Phagocytosis באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ועדשה 40X אובייקטיבית, לכמת את הכמות ידנית של אירועי phagocytic ידי ספירה לפחות 200 מונוציטים ומספר R R 2 phagocytosed 2 בתוך מונוציטים אלה. יש מונה אחד בכל יד לכמת את מספר זמנית של מונוציטים ומספר R 2 R phagocytosed 2. השג את מדד phagocytic הממוצע על ידי חלוקת מספר R R 2 phagocytosed 2 במספר מונוציטים ומכפילים אותו 100. אקספרס הנתונים כממוצע (מדד phagocytic הממוצע) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). </li>

Representative Results

על ידי ביצוע השלבים המכריעים איור 1 ו ההליך המתואר לעיל, MMA יכול להתבצע reproducibly. IVIG שימש כדוגמה עבור עיכוב של phagocytosis באיור 2. IVIG ידוע להיקשר ולחסום את קולטני Fc, ובכך מעכב את התוצאה במורד הזרם של phagocytosis. על ידי titrating את כמות IVIG בשימוש, עיכוב תלויי מינון הוא ציין, שבו ריכוזים מעל 200 מיקרוגרם / מ"ל הביא קרוב ל -100% עיכוב וריכוזי מתחת ל -0.5 מיקרוגרם / מ"ל לא לעכב בכלל (איור 2 א). כאשר המדדים phagocytic הופכים ו מנורמל שליטה חיובית R 2 R 2 0% עיכוב, עקומת עיכוב עם IC 50 של 3 מיקרוגרם / מ"ל ניתן לקבוע (איור 2 ב). בנוסף ביצוע assay בעקביות, quantification של assay יכול לפעמים להיות קשה. איור 3 הוא אוסף של תמונות מיקרוסקופ שלב בניגוד שקופיות MMA שונים. עם ניסיון מיקרוסקופיה, ניתן להבחין מונוציטים מתוך RBC זיהום (איור 3D), או vacuole מתוך RBC phagocytosed (איור 3 ב). אשכולות צפופים של תאים ו / או פסולת יש להימנע במהלך (3E הדמוי ו- F) כימות. כמו כן, יש להימנע יתר opsonizing ה- R R 2 2 RBC, מה שיוביל phagocytosis המוגברת overcrowds הפנים מונוציטים ומפריע כימות מדויק (איור 3 ג). איור 1. תרשים סכמטי של MMA. צעד אחר צעד תיאור של השלבים המכריעים MMA: בידוד PBMC מדם כולו, להאכיל את monocyt דבקהes עם R R 2 opsonized 2, ועל שטיפת שקופיות קאמרית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. תוך ורידי IgG (IVIG) מעכב phagocytosis במבחנה באמצעות MMA. IVIG ידוע כמעכב phagocytosis והוא משמש פקד עיכוב ב MMA האדם. (א) טיטרציה של IVIG הביאה עיכוב תלוי במינון של phagocytosis כאשר לעומת שליטת 2 R R 2 שלא טופלה. התוצאות מראות את ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של n = 3 ניסויים. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות -test t הסטודנט: ** P≤0.01 ו *** P≤0.001. (ב) עקום עיכוב של IVIG עם IC 50 of 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​(הקו המקווקו). התוצאות מראות נתונים מנורמלים מטופל R 2 R 2 (עיכוב 0%); ממוצע ± SEM של n = 3 ניסויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. תמונות מיקרוסקופיה שלב בניגוד שקופיות מדגם בהגדלה 40X. (א) השקופית מושלמת שבה מונוציטים phagocytosed 1-2 R 2 R 2 בממוצע (חיצים שחורים עם זוהר הילה מיוחד), עם קובץ פוגע מעט מאוד, בלתי phagocytosed R 2 R 2 (חצים לבנים) ברקע. (ב) כפי שניתן לראות שקופית זו, מונוציטים לפעמים יש vacuoles מוגדל (חצים לבנים), אשר יכולים להיחשב בטעות R R 2 phagocytosed 2. (C </ strong>) כאשר R 2 R 2 כבר מעל-opsonized, יותר מ 4-5 phagocytosed R 2 R 2 לכל מונוציטים (חיצים שחורים) לדקלם מדויק לספור קשה, מאז R R 2 2 מצטופפים בתוך מונוציטים ותא ברורים גבולות לא ניתן להבחין. (ד) כביסה לקויה של השקופית מובילה זיהום R 2 R 2 בשפע (חצים לבנים), אשר יכול להיחשב בטעות RBCs הדבק. (E) לפעמים, מונוציטים ו RBCs זיהום עלול להיווצר אשכולות. אשכולות להצביע גם זיהום חיידקים, אשר יש להימנע. (F) מונוציטים עלול להיווצר אגרגטים גדולים, אשר יש להימנע במהלך כימות. באמצעות בחירה אקראית של השדות כדי להציג, פנל מה הוא ציין בדרך כלל אם MMA שבוצע כהלכה. סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

MMA היא טכניקה מייגעת הדורש התמחות בתרבות היא רקמות מיקרוסקופיה. ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח הצלחה: 1) דור בשכבה מונוציטים; 2) opsonization של RBCs, ו -3) כימות ידנית. בשכבה מונוציטים אינה נצמדת חזק מאוד לשקופית התא, אז pH פיזיולוגי חייב להישמר לאורך כל assay 11 ו מספר מספיק של PBMCs צריך להיות זורעים. pipetting הנמרץ, אשר עלול להפריע את התאים הדבקים, יש להימנע. גישה אחת היא תמיד להסיר ולהוסיף פתרונות מאותו בפינה של החדר על מנת להבטיח כי הבקשה היא איטית ויציבה. בדומה לכך, במהלך שלב הכביסה האחרון להסיר את עודפי RBCs, התנועה צריכה להיות איטית ויציבה. הדבר מבטיח הפרעה מינימאלית בשכבה ועדיין הסרת רוב RBCs-phagocytosed האו"ם. שטיפת לקוי תוביל רקע גבוה של RBCs זיהום, מה שהופך קואה ידניתntification קשה. שנית, את RBCs R 2 R 2 חייב להיות opsonized מספיק כדי לקבל מדד phagocytic ממוצע של 80-120 על בקרת phagocytosis. מגוון phagocytic הרצוי זו מאזנת בין הקלות הספירה (למשל, מונוציטים עם יותר מ -5 phagocytosed RBCs שקשה לכמת במדויק) ושמירה על כמות נאותה של phagocytosis לניתוח סטטיסטי. מידת opsonization יכול להיות מאושרת על ידי ה- IAT, וכן קריאה בין 3+ כדי 4+ נדרשת. ה- R R 2 2 RBCs אמור להיות מושלך כאשר יש תמוגה עודף במהלך הכביסה, כאשר supernatant הופך לאדום כהה, או כאשר חל קיטון משמעותי phagocytosis הוא ציין בניסויים בשל הזדקנות התאים אחסון. לבסוף, כימות ידנית באמצעות מיקרוסקופ יכולה להיות מסובכת, במיוחד כאשר משווה ספירה בין אנשי מעבדה ובין ניסויים. על ידי בחינה באותו התחום על כל טוב, או פשוט על ידי ספירת תאים נוספיםניתן להשיג, ספירה יותר עקבית. אימון Side-by-side עם טכנאי מנוסה ושימוש סט מיועד של שקופיות אימון מומלץ.

ביקורת גדולה של MMA היא הסובייקטיביות של צעד כימות הידני. עם זאת, עם הכשרה מתאימה, עקביות ניתן להשיג על דלפקים שונים. מגבלה נוספת היא ההבדלים התורם אל התורם מהותי ביכולות phagocytic מונוציטים וב R 2 רמות הביטוי אנטיגן R 2 משטח, אשר מהווה מקור וריאציה נתונים בעת התמודדות עם דגימות אנושיות.

טכניקות חלופיות אחרות זמינות לבחינת phagocytosis בתיווך FcγR. רוב הערכות מסחריות לנצל פלט ניאון כדי לפקח phagocytosis (למשל, bioparticles, חלבון פלואורסצנטי pH רגיש, או חרוזי לטקס ניאון שכותרתו IgG). שימוש פלט פלורסנט האם להציע כימות אובייקטיבי יותר, אבל צריך גם להונותסדר את הזמינות, עלות, והכשרה הקשורים לשימוש של מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometer זרימה, כמו גם את התלות שהתפתחה על ערכות זמינות מסחרי.

לבסוף, assay זה יכול להיות שונה בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמה, כאשר בודקים עיכוב התרופה של phagocytosis, מונוציטים יכול להיות מראש שטופלו או מודגרות שיתוף עם שני הסמים RBCs opsonized (כלומר, assay התחרות). את האיתות במורד הזרם של נוגדנים של תת-סוגים שונים, נוגדנים כימרי, או בונה רקומביננטי יכול להיות גם נבדק. עם פריצות הדרך אחרונות בפיתוח של דם אנטיגן-null אוניוורסלי 24, MMA יכול להיות מנוצל מסך ראשוני של RBCs אנטיגן-null אלה עם נוגדנים שונים כדי להעריך האם אכן קיימת יעילות וריד מעורר phagocytosis.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services’ Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells  Canadian Blood Services Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) 
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A., et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Tags

Monocyte Monolayer AssayFc Receptor-mediated PhagocytosisImmunohematologyBlood TransfusionAuto-antibodiesAllo-antibodiesRed Blood CellsOpsonizationPolyclonal Anti-D AntibodiesPBMCDensity Gradient CentrifugationIn Vitro Functional Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image