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Immunology and Infection

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Published: January 02, 2017
doi:
10.3791/55039
,
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,University of Toronto, 2Centre for Innovation,Canadian Blood Services

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Holen Sie die Genehmigung für die Verwendung von menschlichen Proben von der Forschungsethikkommission / Institutional Review Board, und zu erhalten unterzeichnet Zustimmung von allen menschlichen Spendern. Die MMA kann auch als menschliche Test in ähnlicher Weise mit der Maus PBMCs durchgeführt werden, nach Genehmigung durch den Tiernutzung Ethik. Die MMA nutzt aseptischen Gewebekulturtechniken. HINWEIS: Siehe Abbildung 1. Hinweis: Obwohl wir die Verwendung eines Level 2 biocontainment Schrank während des Tests empfehlen aseptischen Bedingungen zu erhalten, da das Verfahren nur eine "kurzfristige" Kulturverfahren ist, gibt es nicht wirklich genug Zeit für die Bakterien den Test zu verunreinigen. Daher wird, wenn ein Level-2 biocontainment Schrank nicht existieren, sondern als ein nur kaufen, für diesen Test, könnte der Test außerhalb eines biocontainment Schrank durchgeführt werden, auf einer offenen Bank. Die Verwendung eines 37 ° C – Inkubator mit 5% CO 2, jedoch ist keine Option und muß verwendet werden ,optimale Ergebnisse. 1. Pbmc Isolation Erhalten menschlichem Vollblut von einem gesunden Spender oder einen Patienten über Venenpunktur mit Vacutainer haltige Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulans (gelb-Top-Rohre). HINWEIS: Vollblut kann in ACD bei Raumtemperatur (18-22 ° C) für bis zu 36 h gelagert werden , bevor 11 zu dem nächsten Schritt fortgefahren wird . Normalerweise sind Oktober 1-02 ml-Vacutainer-Röhrchen Vollblut für den Test ausreichend. Verdünne das Vollblut 1: 1 v / v in warmem komplettem RPMI-Medium (RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES und 0,01 mg / ml Gentamicin). Isolieren einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) aus dem verdünnten Vollblut Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung, wie vom Hersteller empfohlen (siehe Materialliste). Schicht, die das verdünnte Blut sehr langsam über den Dichtegradienten (erwärmt auf Raumtemperatur 18-22 ° C). HINWEIS: Minimieren Sie die Menge von mixifür die optimale Trennung von Blut an der Schnittstelle ng durch sorgfältig die Blutmischung in tropfenweise Schichtung oder durch eine Pipette. Lassen Sie das Blut Mischung langsam auf die Oberseite des Dichtegradienten Schicht über durch die Pipettenspitze nahe dem Dichtegradienten platzieren und durch die Blut-Gemisch ermöglicht die Seite des Rohres sehr langsam abzulaufen. Je nach Umfang des Experiments Schicht 10 ml Blut Mischung oben auf 3 ml Dichtegradienten (in einem 15-ml-Röhrchen) oder Schicht 35 ml Blut Mischung oben auf 15 ml Dichtegradienten (in einem 50-mL Tube). Typischerweise wurden 10 ml Vollblut ergibt 10.000.000 PBMCs mit einiger Spender zu Spender Variation. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, dass es keine Vermischung der mit dem Dichtegradienten Blut-Gemisch ist. Die Blutmischung sollte die Dichte Gradientenschicht über und langsam ansteigen, bis das gesamte Blut auf der Oberseite des Dichtegradienten ist. Zentrifugieren der geschichteten Mischung bei 700 × g für 30 Minuten ohne Bremsen. Die centrifuged Mischung sollte in fünf Schichten trennen (von oben nach unten): Plasma, Buffy-Coat (mit PBMCs), Dichtegradientenmaterial, Granulozyten und roten Blutkörperchen. Zu entfernen und die Mehrheit der Plasma verwerfen und Abrufen sorgfältig die buffy coat (PBMC) Inhalt in eine neue 15-ml-Röhrchen mit einer Pasteurpipette und einen Saugball verwenden. HINWEIS: Die Entfernung der buffy coat-Schicht wird durch Aufbringen Saugwirkung am Pasteur-Pipette effektiv durchgeführt, während eine kreisförmige Bewegung um die Außenseite der Schicht durchgeführt wird, mit der Spitze der Pipette gegen das Rohr. Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in pH 7,3 Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), indem bei 350 × g für 10 min (mit voller Bremsen) zwischen Wäschen Zentrifugieren. Die Rekonstitution der PBMC Pellet in komplettem RPMI-Medium. Abhängig von der Größe des Pellets, 3-7 ml Medium ausreichend. Zählen Sie die PBMC mit Trypanblau und einer Zählkammer. Nur diejenigen Zellen zählen, die durch die Trypanblau nicht gefärbt sind. Reconstitute die PBMCs bis 1.750.000 Zellen / ml in komplettem RPMI-Medium. Seed 400 & mgr; l (700.000 Zellen) in jede Vertiefung einer 8-Kammer-Folie. Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C, vollständig befeuchteten Gewebekultur – Inkubator für 1 h (mit 5% CO 2 ergänzt) werden die Monozyten / Makrophagen anhaften zu ermöglichen. 2. Vorbehandlung von anhaftendem Monozyten HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn der Suche nach Möglichkeiten Phagozytose zu hemmen oder zu verstärken. Vorzubehandeln geklebt Monozyten bei jedem Medikament (en) oder Verbindung (en) von Interesse. Die Rekonstitution der Droge (n) oder andere Testmaterial zu dem RPMI-Medium mit kompletten gewünschte Konzentration. HINWEIS: beispielsweise 200 & mgr; g / ml IVIG wird typischerweise verwendet, um eine 95-100% ige Hemmung der Phagozytose zu erhalten, wenn die menschliche Monozyten verwendet. Absaugen und den Überstand verwerfen jegliche nicht-haftenden Zellen aus der 8-Kammer Folie, nach der 1-stündigen Inkubation, die (nach dem Schritt 1.6). Ersetzen Sie es mit 400& mgr; l eines Arzneimittels oder einer anderen Behandlung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h. Beim Ansaugen und Lösungen in der 8-Kammer Schieber ersetzen, stellen Sie sicher, den Fluss der Flüssigkeiten zu kontrollieren, so dass schwach anhaftenden Zellen heben nicht ab. Auch die Arbeit mit nur 2-3 leeren Brunnen zu einer Zeit und vermeiden die Brunnen trocknen. HINWEIS: In der Regel jede Behandlung in technischen dreifacher Ausführung durchgeführt wird. 3. Opsonisierung von R 2 R 2 Rote Blutzellen HINWEIS: Die R 2 R 2 hier verwendet werden , von der Blutentnahme Center (Canadian Blood Services) erhalten, aber sie sind auch im Handel erhältlich. Opsonisiertem R 2 R 2 RBCs werden als positive Kontrolle für FcyR-vermittelte Phagozytose verwendet. Naïve R 2 R 2 sollte in Alsever Lösung aufbewahrt werden (zur Verlängerung der Haltbarkeit verlängern) bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Alsever-Lösung im eigenen Haus hergestellt und besteht aus 0,8% W / v Trinatriumcitrat (Dihydrat), 1,9% w / v Dextrose, 0,42% w / v Natriumchlorid und 0,05% w / v Citronensäure (Monohydrat). Wenn R 2 R 2 Zellen nicht vorhanden sind , andere Rh-phänotypisiert Zellen, wie R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R oder R 2 r, können verwendet werden. Wasch R 2 R 2 (CDE / cDE) roten Blutzellen in PBS insgesamt dreimal bei 350 xg für 5 min unter Verwendung jeder Zentrifugation. HINWEIS: Die Menge der roten Blutkörperchen benötigt wird, hängt von der experimentellen Größe und kann zurückgerechnet werden. Immer waschen eine überschüssige Menge an RBCs, da RBCs bei jeder Wäsche aufgrund der Lyse oder während der Entfernung des Überstandes verloren gehen. Beispielsweise in einem Experiment mit 5 Behandlungen und 2 Kontrollen, die alle in der technischen Triplikaten durchgeführt, gibt es insgesamt 21 Vertiefungen. 21 Vertiefungen mit 400 ul / Vertiefung von 1,25% RBC Gemisch zeigt an, dass 105 & mgr; l gepackte, opsonisiertes RBC benötigt. 200 & mgr; l RBC sollte zunächst gewaschen und 150 & # werden181; L sollte sicherstellen, opsonisiertes werden, dass es eine ausreichende Menge an RBCs für die Phagozytose Schritt. Opsonisieren des gewaschenen R 2 R 2 Pellet mit 1: 1 v / v polyklonalen Anti-D – Antikörper aus menschlichem Serum und Inkubation für 1 h bei 37 ° C, mit intermittierendem Mischen. HINWEIS: Wenn polyclonale anti-D-Antikörper nicht vorhanden sind, ist es möglich, monoklonale Anti-D-Antikörper zu verwenden, die im Handel erhältlich sind, oder Anti-D, die normalerweise für Rh Immunprophylaxe verwendet wird, die von Blutbanken oder Transfusion erhalten werden kann, Dienstleistungen. Optimierungstests sollten am Anfang durchgeführt werden, wenn der Test einrichten, und wenn viele un-Titer bestimmt polyklonalen Antikörpern oder Umschalten auf einen monoklonalen Antikörper, umgeschaltet wird. Dies ist die optimale Konzentration oder das Volumen der anti-D für ein Antiglobulin-Test (IAT) Ergebnis zwischen 3+ und 4+ und Phagozytose Ergebnis zwischen 70-90 phagozytierten RBCs pro 100 Monozyten gezählt erforderlich zu identifizieren. Waschen Sie die opsonisierend R 2 R 2 insgesamt dreimal in PBS unter Verwendung von Zentrifugation bei 350 xg für 5 min je. HINWEIS: Erfolgreiche Opsonisierung von R 2 R 2 kann durch die Durchführung einer indirekten IAT bestätigt werden. Kurz gesagt, sind sekundäre polyklonalen anti-human-Antikörper hinzugefügt primäre opsonierende Antikörper auf RBC Oberflächen zu binden, und das verstärkte Signal kann in Form von Hämagglutination beobachtet werden. Eine detaillierte Hersteller-Protokoll kann in der ergänzenden Materialien Datei. Rekonstituieren des gewaschenen R 2 R 2 Pellet auf 1,25% v / v mit kompletten RPMI Medium. HINWEIS: Überschüssiges opsonisiertem R 2 R 2 kann für bis zu einer Woche in Alseversche Lösung bei 4 ° C gelagert werden. 4. Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose Aspirieren das Medikament oder mittlerer Überstand aus dem 8-Kammerobjektträger und füge 400 & mgr; l der 1,25% v / v R 2 R 2 -Gemisch. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. Achterner 2 h Inkubation, entfernen Sie die Kammern des Herstellers Adapter verwenden. Dab Überschuss R 2 R 2 auf einem Papiertuch ab. Stellen Sie sicher, dass der Schieber nicht austrocknet. Füllen Sie einen 100-ml-Becher mit PBS. Versenken und waschen Sie die Folie langsam den Schlitten zurück zu bewegen und her (um 30-40 Schläge) 2 die Mehrheit der un-phagocytosed R 2 R zu entfernen. Entfernen Sie die Folie aus der PBS. Abtupfen überschüssige PBS mit einem Papiertuch oder einem Gewebe und der Luft trocknen Sie die Folie. Fixieren Sie die luftgetrockneten Objektträger in 100% Methanol für 45 s. Dann Luft trocknen die feste Folie. HINWEIS: Die Objektträger fixiert werden kann andere Methode verwendet , die mehr kompatibel für Downstream – Färbung, wie beispielsweise die Grünwald-Giemsa – Färbung 21 oder der Wright-Giemsa – Färbung 22 ist. Montieren Sie die Folie unter Verwendung eines in-house-made Elvanol Eindeckmediums (oder einem anderen handelsüblichen Montagemedium) und fügen Sie Deckgläser. HINWEIS: Elvanol Befestigungsmedium von 15% w / v po bestehtlyvinyl Alkoholharz und 30% v / v Glycerin in PBS. Die Mischung wird erhitzt, bis das gesamte Harz gelöst hat, und das Glycerin homogen vermischt. Dies kann mit anderen handelsüblichen Montagemedium ersetzt werden. Lassen Sie die Halterung über Nacht vor der Quantifizierung zu trocknen. 5. Quantifizierung von Phagocytose Unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop und einem 40X Objektiv, quantifizieren manuell die Menge an phagozytischen Ereignisse von mindestens 200 Monozyten zu zählen und die Anzahl der phagozytierten R 2 R 2 innerhalb dieser Monozyten. Haben einen Zähler in jeder Hand , um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R 2 R 2 quantifizieren. Besorgen Sie sich die durchschnittliche phagozytische Index durch die Anzahl der Phagozytose von R 2 R 2 durch die Anzahl der Monozyten Dividieren und Multiplizieren mit 100 Express die Daten als Mittelwert (Durchschnitt phagozytische Index) ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). </li>

Representative Results

Durch Befolgen der entscheidenden Schritte in Figur 1 und dem oben beschriebenen Verfahren kann das MMA reproduzierbar durchgeführt werden. IVIG wurde als Beispiel für die Hemmung der Phagozytose in Figur 2 verwendet. IVIG ist bekannt, die Fc-Rezeptoren zu binden und blockieren, wodurch das Downstream-Ergebnis der Phagozytose hemmen. Durch Titration der Menge von IVIG verwendet, eine dosisabhängige Hemmung beobachtet wird , in welchen Konzentrationen oberhalb von 200 pg / ml in der Nähe führte zu 100% ige Hemmung und Konzentrationen von weniger als 0,5 g / ml hemmte nicht (2A). Wenn die phagozytischen Indizes werden transformiert und normiert auf die R 2 R 2 positive Kontrolle als 0% Hemmung, eine Hemmkurve mit einem IC 50 von 3 & mgr; g / mL (2B) bestimmt werden kann. Zusätzlich zu den Assays konsequent durchführen, quantification des Assays kann manchmal schwierig sein. Figur 3 ist eine Sammlung von Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von verschiedenen MMA Dias. Mit Mikroskopie Erfahrung kann man ein Monozyt aus einer kontaminierenden RBC (3D) oder ein von einer Vakuole phagozytierten RBC (3B) unterscheiden. Dichtes Cluster von Zellen und / oder Ablagerungen sollten während Quantifizierung (Figuren 3E und F) vermieden werden. Auch sollte man vermeiden , über opsonisierenden die R 2 R 2 RBC, die zu einem erhöhten Phagozytose führen würde, die die Monozyten Interieur und stört die genaue Quantifizierung (3C) overcrowds. Abbildung 1. Schematische Darstellung des MMA. Ein Schritt-für-Schritt-Darstellung der entscheidenden Schritte bei der MMA: PBMC aus Vollblut zu isolieren, um das anhaftende monocyt Einspeisenes mit opsonisiertem R 2 R 2, und die Kammer gleitet waschen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Die intravenöse IgG (IVIG) hemmt Phagozytose in vitro die MMA mit. IVIG ist bekannt Phagozytose zu hemmen und als Inhibitionskontrolle im menschlichen MMA verwendet. (A) Titration von IVIG führte zu einer dosisabhängigen Hemmung der Phagozytose verglichen , wenn mit dem unbehandelten R 2 R 2 Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) von n = 3 Experimenten. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student t – Test durchgeführt: ** p ≤ 0,01 und *** p ≤ 0,001. (B) Hemmung Kurve von IVIG mit einem IC 50 of 3 & mgr; g / ml (gepunktete Linie). Die Ergebnisse zeigen , Daten normalisiert zu unbehandelten R 2 R 2 (0% Hemmung); Mittelwert ± SEM von n = 3 Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Phasenkontrast – Mikroskopie – Aufnahmen von Musterfolien unter Vergrößerung 40X. (A) Die perfekte Folie in dem die Monozyten phagozytiert 1-2 R 2 R 2 im Durchschnitt (schwarze Pfeile mit einem unverwechselbaren Halo leuchten), mit sehr wenigen verunreinigenden, un phagozytierte R 2 R 2 in den Hintergrund (weiße Pfeile). (B) Wie in dieser Folie gezeigt, manchmal Monozyten haben vergrößert Vakuolen (weiße Pfeile), die für phagozytierten R 2 R 2 verwechselt werden können. (C </ strong>) Wenn R 2 R 2 haben over-opsonisiertes, mehr als 4-5 phagozytiert R 2 R 2 pro Monozyt (schwarze Pfeile) rendern genaues Zählen schwierig, da 2 der R 2 R innerhalb der Monozyten- und verschiedene Zell gedrängt werden Grenzen können nicht unterschieden werden. (D) Eine unzureichende Waschen des Schiebers führt zu reichlich R 2 R 2 Verunreinigung (weiße Pfeile), die eingehalten RBCs verwechselt werden könnte. (E) Manchmal, Monozyten und kontaminierenden RBCs können Cluster bilden. Cluster zeigen auch bakterielle Kontamination, die vermieden werden sollten. (F) Monocyten können größere Aggregate bilden, die während der Quantifizierung sollte vermieden werden. Mit zufällige Auswahl der Felder anzuzeigen, ist Feld A, was in der Regel, wenn der MMA beobachtet wird ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Maßstabsbalken ist 20 & mgr; m. Klicken Sie bitte hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die MMA ist ein mühsames Verfahren, das Know-how sowohl in Gewebekultur und Mikroskopie erfordert. Es gibt mehrere wichtige Schritte, um Erfolg zu gewährleisten: 1) Erzeugung der Monozyten einschichtigen; 2) Opsonisierung der RBCs und 3) manuelle Quantifizierung. Die Monocyten – Monolayer nicht haftet sehr stark an der Kammer Rutsche, so physiologischen pH – Wert muß während des gesamten Assays 11 und eine ausreichende Anzahl von PBMCs beibehalten werden sollte ausgesät werden. Heftiges Pipettieren, die die anhaftenden Zellen stören könnten, sollten vermieden werden. Ein Ansatz ist es, immer entfernen und fügen Lösungen aus der gleichen Ecke der Kammer und um sicherzustellen, dass die Bewegung langsam und stetig ist. In ähnlicher Weise während des letzten Waschschritt das überschüssige RBCs zu entfernen, sollte die Bewegung langsam und stetig sein. Dies sorgt für minimale Störung der einschichtigen, während immer noch die Mehrheit der un-phagocytosed RBCs zu entfernen. Korrektes Waschen zu einem hohen Hintergrund von verunreinigenden roten Blutkörperchen führen, die eine manuelle qua machtntification schwierig. Zweitens müssen die R 2 R 2 RBCs ausreichend einen durchschnittlichen phagozytischen Index von 80-120 für die Phagozytose Steuerung erhalten werden opsonisiert. Diese gewünschte phagozytischen Bereich ein Gleichgewicht zwischen der Leichtigkeit des Zählens auftrifft (beispielsweise Monozyten , die mit mehr als 5 phagozytiert RBCs nur schwer genau zu quantifizieren) , und eine ausreichende Menge an Phagozytose für die statistische Analyse beibehalten wird . Der Grad der Opsonisierung durch einen IAT und ein Wert zwischen 3+ bis 4+ erforderlich bestätigt werden. Die R 2 R 2 RBCs sollte verworfen werden , wenn es überschüssige Lyse während des Waschens, wenn der Überstand dunkel rot wird, oder wenn eine signifikante Abnahme der Phagozytose wird in Experimenten aufgrund der Alterung der Zellen bei der Lagerung beobachtet. Schließlich manuelle Quantifizierung des Mikroskops kann schwierig sein, vor allem, wenn Zählungen zwischen Laborpersonal und zwischen den Experimenten verglichen werden. Durch das gleiche Feld eine Prüfung jeder Vertiefung oder einfach durch mehr Zellen zu zählenKann eine konsistentere Zahl erhalten werden. Side-by-Side-Training mit einem erfahrenen Techniker und die Verwendung eines bestimmten Satz von Trainings Dias wird empfohlen.

Eine wichtige Kritik an der MMA ist die Subjektivität des manuellen Quantifizierung Schritt. Doch mit der entsprechenden Ausbildung, Konsistenz über verschiedene Zähler erhalten werden. Eine weitere Einschränkung ist die intrinsische Donor-zu-Donor Unterschiede in phagozytischen Fähigkeiten Monozyten- und in R 2 R 2 – Oberflächenantigen – Expressionsniveaus, die eine Quelle der Datenvariation ist , wenn sie mit menschlichen Proben handelt.

Andere alternative Techniken zur Verfügung, für die Prüfung FcyR-vermittelte Phagozytose. Die Mehrheit der kommerziellen Kits verwenden fluoreszierende Ausgangs Phagozytose (zB Biopartikel, pH-empfindlichen Fluoreszenzprotein oder IgG-markierte fluoreszierende Latexkügelchen) zu überwachen. Die Verwendung von fluoreszierenden Ausgang nicht bieten mehr objektive Quantifizierung, aber man muss auch conSider der Verfügbarkeit, Kosten und unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops zugeordnet Ausbildung oder einem Durchflusszytometer, sowie der anschließenden Abhängigkeit von kommerziell erhältlichen Kits.

Schließlich kann dieser Test in Abhängigkeit von der Fragestellung angepasst werden. Wenn beispielsweise Arzneimittel Hemmung der Phagozytose testen, können Monozyten entweder vorbehandelt oder co-inkubiert mit den beiden Arzneimitteln und opsonisiertem RBCs (dh ein Kompetitions – Assay). Die stromabwärtige Signalgebung von Antikörpern verschiedener Subtypen, chimäre Antikörper oder rekombinante Konstrukte können auch getestet werden. Mit den jüngsten Durchbrüchen in der Entwicklung eines universellen antigen-null Blut 24 könnte die MMA in anfänglichen Screens dieser antigen-null RBCs mit verschiedenen Antikörpern verwendet werden , um festzustellen , ob es tatsächlich eine abgesenkte Wirksamkeit in Phagozytose auszulösen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services’ Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells  Canadian Blood Services Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) 
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).
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