Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren

Het verkrijgen van goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters door de ethische raad van bestuur / institutionele review board, en het verkrijgen van ondertekend toestemming van alle menselijke donoren. De MMA kan ook worden uitgevoerd met PBMC muis op dezelfde wijze als de menselijke test na gebruik dierenethiek goedkeuring. De MMA maakt gebruik van aseptische weefselkweek technieken. OPMERKING: Zie figuur 1. LET OP: Hoewel we raden het gebruik van een level 2 biocontainment kabinet tijdens de test om aseptische techniek te behouden, als de methode is slechts een "short-term" cultuur-methode, is er niet echt genoeg tijd voor bacteriën om de test besmetten. Daarom, als een niveau 2 biocontainment kast niet bestaat, dan kopen alleen voor deze test, het assay kan worden uitgevoerd buiten een biocontainment kast, op een open bank. Het gebruik van een 37 ° C incubator met 5% CO 2 echter geen optie en moet worden gebruikt vooreen optimaal resultaat. 1. perifere mononucleaire Cell Isolation Verkrijgen van menselijk geheel bloed van een gezonde donor of een patiënt via venapunctie met behulp van vacutainers met zuur-citraat-dextrose (ACD) antistollingsmiddel (geel-top buizen). OPMERKING: Volbloed kunnen worden opgeslagen in ACD bij kamertemperatuur (18-22 ° C) gedurende 36 uur alvorens de volgende stap 11. Gewoonlijk 1-2 10 ml vacutainer buisjes volbloed voldoende voor de test. Verdun het geheel bloed 1: 1 v / v in warm compleet RPMI-medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 20 mM HEPES en 0,01 mg / ml gentamicine). Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) uit het verdunde volbloed met behulp dichtheidsgradiënt centrifugatie, zoals aanbevolen door de fabrikant (zie lijst van materialen). Laag het verdunde bloed langzaam via dichtheidsgradiënt (verwarmd tot kamertemperatuur, 18-22 ° C). OPMERKING: Beperk de hoeveelheid mixing van de interface voor de optimale scheiding van het bloed door voorzichtig lagen bloed mengsel druppelsgewijze of met behulp van een pipet. Laat het bloed mengsel langzaam laag over de bovenkant van de dichtheidsgradiënt door het plaatsen van de pipet tip nabij de dichtheidsgradiënt en doordat het bloed mengsel afstromen van de buis langzaam. Afhankelijk van de schaal van experiment laag 10 ml bloed mengsel boven 3 ml dichtheidsgradiënt (in een 15 ml buis) of laag 35 ml bloed mengsel bovenop 15 ml dichtheidsgradiënt (in een 50-mL buis). Kenmerkend 10 ml volbloed levert 10 miljoen PBMC, met enkele donor tot donor variatie. Opmerking: Het is zeer belangrijk dat er geen menging van het bloed mengsel met de dichtheidsgradiënt. Het bloed mengsel moet laag over de dichtheidsgradiënt en langzaam omhoog totdat al het bloed bovenop de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer de gelaagde mengsel bij 700 g gedurende 30 min zonder remmen. de centrifuged mengsel moet scheiden in 5 lagen (van boven naar beneden): plasma, buffy coat (met PBMCs), dichtheidsgradiënt materiaal, granulocyten, en RBC. Verwijder de meeste plasma en nauwkeurig ophalen van de inhoud bufferlaag (PBMC) in een nieuwe 15 ml buis met behulp van een Pasteur pipet en een zuigingsbol. Opmerking: Het verwijderen van de buffy coat-laag effectief gedaan door te zuigen aan de Pasteur pipet tijdens het uitvoeren van een draaiende beweging rond de buitenkant van de laag, met de punt van de pipet tegen de buis. Was de geïsoleerde PBMC drie keer pH 7,3 fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugeren bij 350 g gedurende 10 min (vol remmen) tussen wasbeurten. Reconstitueer de PBMC pellet in volledig RPMI medium. Afhankelijk van de grootte van de pellet, 3-7 ml medium volstaat. Tel de PBMC met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Tellen alleen die cellen die niet zijn gekleurd door de trypan blauw. Reconstitute de PBMC's tot 1.750.000 cellen / ml in volledig RPMI medium. Seed 400 pi (700.000 cellen) in elk putje van een 8-kamer glijbaan. Incubeer de dia in een 37 ° C, volledig bevochtigde weefselcultuur incubator (aangevuld met 5% CO2) gedurende 1 uur om de monocyten / macrofagen te houden. 2. Pre-behandeling van Gekleefd Monocyten LET OP: Deze stap is alleen nodig als op zoek naar manieren om de fagocytose remmen of te verbeteren. Pre-treat gehandeld monocyten met enige drug (s) of de verbinding (en) van belang. Reconstitueer het geneesmiddel (en) of ander testmateriaal om de gewenste concentratie met behulp volledig RPMI medium. Opmerking: Zo wordt 200 ug / ml IVIG doorgaans gebruikt om een ​​95-100% remming van fagocytose verkregen bij gebruik humane monocyten. Aspireren en gooi de supernatant die alle niet-hechtende cellen van de 8-kamer slide na de 1-uur incubatie (na stap 1,6). Vervang het met 400pl van een geneesmiddel of een andere behandeling en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Bij het opzuigen en het vervangen van oplossingen in de 8-kamer glijbaan, zorg ervoor dat de stroom van de vloeistoffen te controleren, zodat zwak gehandeld cellen niet optillen. Ook werken met slechts 2-3 lege putjes tegelijk voorkomen en drogen van de putjes. LET OP: Typisch wordt elke behandeling uitgevoerd in technische drievoud. 3. opsonisatie van R2 R2 Red Blood Cells OPMERKING: De R 2 R 2 hier gebruikt worden verkregen uit de bloedinzamelingscentrum (Canadese Blood Services), maar ze zijn ook commercieel verkrijgbaar. Opsonized R 2 R 2 RBC's worden gebruikt als een positieve controle voor FcyR-gemedieerde fagocytose. Naïve R 2 R 2 moeten tot 1 maand bewaard in Alsever's oplossing (verlengen houdbaarheid) bij 4 ° C. Alsever De oplossing wordt bereid in-house en samengesteld uit 0,8% W / v trinatriumcitraat (dihydraat), 1,9% w / v glucose, 0,42% w / v natriumchloride en 0,05% w / v citroenzuur (monohydraat). Als R 2 R 2 cellen niet beschikbaar zijn, andere Rh-fenotype cellen, zoals R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, R of R 2, kan worden gebruikt. Wash R 2 R 2 (CDE / CDE) rode bloedcellen in PBS totaal driemaal met gebruikmaking van centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk. Opmerking: Het aantal RBC's nodig afhankelijk van de experimentele groot en terug berekend. Was altijd een overmaat RBCs, aangezien RBC bouwen na elke wasbeurt door lysis of tijdens het verwijderen van supernatant. Bijvoorbeeld, in een experiment met 5 behandelingen en 2 controles, uitgevoerd in triplo technische, er in totaal 21 putjes. 21 putjes met 400 ul / putje van 1,25% RBC mengsel blijkt dat 105 pi gepakte, opsonized RBC nodig. 200 pi van RBC moet aanvankelijk worden gewassen en 150 & #181; L moeten worden opsonized om ervoor te zorgen dat er een voldoende hoeveelheid rode bloedcellen voor de fagocytose stap. Opsoniseren het gewassen R 2 R 2 pellet met 1: 1 v / v polyklonale anti-D antilichamen uit humaan serum en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met periodiek mengen. OPMERKING: Indien polyklonale anti-D-antilichamen beschikbaar zijn, is het mogelijk om monoklonale anti-D antilichamen, die commercieel verkrijgbaar zijn, of anti-D dat gewoonlijk wordt gebruikt voor Rh immuun profylaxe, die kunnen worden verkregen bij bloedbanken of transfusie gebruiken diensten. Optimalisatie tests moeten worden uitgevoerd in het begin, bij het opzetten van de test, en wanneer wordt overgeschakeld veel-un getitreerd polyklonale antilichamen of over te schakelen naar een monoklonaal antilichaam. Dit is de optimale concentratie of het volume van anti-D vereist voor antiglobulinetest (IAT) gevolge van tussen 3+ en 4+ en fagocytose gevolg van tussen 70-90 gefagocyteerde erytrocyten per 100 monocyten geteld identificeren. Was de opsoniserend R 2 R 2 in totaal drie keer in PBS middels centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten elk. OPMERKING: Succesvolle opsonisatie van R 2 R 2 kan worden bevestigd door het uitvoeren van een indirecte IAT. Kort samengevat worden secundaire polyklonaal anti-humane antilichamen toegevoegd aan primaire opsoniserende antilichamen binden aan RBC oppervlakken, en het versterkte signaal in de vorm van hemagglutinatie worden waargenomen. Een gedetailleerd fabrikant protocol is te vinden in de aanvullende materialen bestand. Reconstitueer het gewassen R 2 R 2 pellet tot 1,25% v / v behulp volledig RPMI medium. OPMERKING: Excess geopsoniseerde R 2 R 2 kunnen voor tot een week opgeslagen in oplossing Alsever bij 4 ° C. 4. Fc Receptor-gemedieerde fagocytose Zuig het geneesmiddel of medium supernatant van de 8-kamer glijbaan en voeg 400 ul van 1,25% v / v R 2 R 2 mengsel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. achteruiter 2 uur incubatie, verwijder de kamers met behulp van adapters van de fabrikant. Dep het overtollige R2 R2 op een papieren handdoek. Zorg ervoor dat de dia niet uitdroogt. Vul een 100 ml bekerglas met PBS. Onderdompelen en was de schuif door langzaam de slede heen en weer (ongeveer 30-40 slagen) het merendeel van de niet-gefagocyteerd R 2 R 2 verwijderen. Verwijder de dia uit de PBS. Dep het overtollige PBS met behulp van een papieren handdoek of een tissue en air-droog de glijbaan. Bevestig de lucht gedroogd slide in 100% methanol gedurende 45 s. Dan, air-droog de vaste glijbaan. OPMERKING: slides kunnen worden gefixeerd met een andere methode die meer geschikt voor stroomafwaartse kleuring, zoals de Grünwald-Giemsa-kleuring 21 of Wright-Giemsa-kleuring 22. Monteer de dia met behulp van een in-house gemaakt Elvanol montage medium (of een ander in de handel verkrijgbaar montage gemiddeld) en voeg dekglaasjes. OPMERKING: Elvanol fixeermiddel bestaat uit 15% w / v polyvinyl alcohol hars en 30% v / v glycerol in PBS. Het mengsel wordt verhit totdat de hars is opgelost en de glycerine is homogeen gemengd. Deze kan worden vervangen door andere commercieel verkrijgbare fixeermiddel. Laat de mount nacht drogen voordat kwantificering. 5. Kwantificering van fagocytose Met behulp van een fasecontrastmicroscoop en een 40X objectief handmatig de hoeveelheid fagocytische gebeurtenissen gekwantificeerd door het tellen van minimaal 200 monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 binnen deze monocyten. Laat een teller in elke hand gelijktijdig het aantal monocyten en het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 kwantificeren. Verkrijgen van de gemiddelde fagocytose index van het aantal gefagocyteerd R 2 R 2 te delen door het aantal monocyten en vermenigvuldigen met 100. Express de gegevens als de gemiddelde (gemiddelde fagocytische index) ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). </li>