İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
kadın üreme yolları (FRT) mukozal bağışıklık sistemi ilk savunma hattı olarak hizmet vermektedir. Genital mukozanın daha iyi bilgi HIV dahil olmak üzere farklı patojenlerin patojenitesini anlamak için elzemdir. Gama ö (GD) T hücreleri 'alışılmamış' T hücrelerinin prototipi ve gamma ve delta zincirlerinden oluşan heterodimerik T hücre reseptörleri (TCR'ler) kendi ekspresyonu ile tanımlanan T hücrelerinin görece küçük alt grubunu temsil eder. Bu alfa-beta TCR ile tanımlanır klasik ve daha iyi bilinen CD4 + yardımcı T hücreleri ve CD8 + sitotoksik T hücreleri ayıran. GD T hücreleri genellikle dokuya özel dağılımını gösteren ve epitelde zenginleştirilmiştir. GD T hücreleri iltihap, tümör gözetimi, enfeksiyon hastalıkları ve otoimmünite immün yanıtları düzenlemişlerdir.
Burada, tekrarlanabilir izole ve insan endoservikal intraepitelyal GD T lenfositleri analiz etmek için bir yöntem mevcut. Biz haKadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) katılan kadınlardan kullanılan endoservikal cytobrush örnekleri ettik. vajinal mukoza hakaret var olduğu koşulları sırasında GD T hücreleri etkileşimleri hakkında bilgi vajinal microbicides.In ek geliştirilmesi dahil olmak üzere, mukozal açığı ele aldığı herhangi bir klinik çalışmada uygulanan olabilir, mukozal GD T hücre yanıtları hakkında bilgi vardır enfeksiyonlu hastalıkların tedavi edilmesi GD T hücre tabanlı immün terapinin uygulanması için potansiyeli.
Introduction
Biz intraepitelyal GD T hücrelerini değerlendirmek için endoservikal fırça örneklerini kullanarak metodolojisini geliştirdi. endoservikal kanal kolumnar epitel tek bir tabaka ile kaplı olduğu. İntraepitelyal lenfositler patojen mikropların 7, 8 karşılaşmak üzerine immün yanıtları hızla başlatabilir epitel tabakası içinde ikamet cephe lenfositler temsil etmektedir. endoservikal intraepitelyal bölmenin immünolojik olayların anlaşılması HIV de dahil olmak üzere hastalıklardan korunmak için etkili stratejiler tasarımı için önemlidir.
Önerilen yöntem, bundan başka, HIV enfeksiyonu ya da HIV enfeksiyonu riski taşıyan kadınlarda intraepitelyal GD T hücrelerinin rolünün anlaşılması için çalışmalar yeni toplanmış insan endoservikal örneklerinde hem de dondurulmuş endoservikal hücreler için uygulanabilir. Bu protokolün ana amacı endoservikal intraepitelyal bölmede yeni immünolojik olayları keşfetmek ve değerlendirme, içinHIV enfeksiyonu olan kadınlarda mukozal açığına bir göstergesi olarak e GD T hücresi tepkileri.
FGT bağışıklık etrafında bilgide önemli boşluklar başarıyla toplanması ve mukozal örnekleri işleme zorluk kısmen kaynaklanmaktadır. Ayrıca, karmaşık mukozal bağışıklık hücrelerinin heterojen ve birbirleri ile birbirine bağlılığı, bağışıklık sisteminin durumunu ve yeteneği yansıtan klinik olarak önemli ölçümler belirlenmesi için önemli zorluklar vardır. Biz daha olacak FRT dokunulmazlık yatan mekanizmaları belirlemek için kritik olabilir son derece mültipleksli, tek hücreli teknolojileri kullanılarak analiz edebilir yüksek derecede saflaştırılmış intraepitelyal GD T hücrelerini elde etmek için bir yöntem geliştirdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
kadın alt genital sistem mukoza açığına değerlendirilmesi, HIV edinimi ve bulaşma riskini ele klinik çalışmaların önemli bir bileşenidir. Tipik haliyle, HIV enfeksiyonuna FGT güvenlik genital salgıları (sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptitler) 12, 13 içinde çözünür immün modülatörler ölçerek değerlendirilir. Ancak, bu biyobelirteçler, vajinal iltihap sadece göstergesidir fizyolojik ve patolojik olaylardan etkilenir ve her …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu çalışmalarına katılmak için istekli olduklarını Miami WIHS çalışma katılımcılara teşekkür ederiz. Bu yazıda veriler Miami Kadın Kurumlararası HIV Çalışması (WIHS) ile toplanmıştır. Bu yayının içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma İlerletme Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve Kadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) [hibe sayısı U01 AI103397], Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı P30AI073961] National Institutes, Ulusal Merkezi tarafından desteklenen Sağlık translasyonel Bilimleri ve Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların Ulusal Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı UL1TR000460 ve 1KL2TR000461] Ulusal Enstitüsü, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü [hibe sayısı K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
