ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
女性の生殖器官（FRT）粘膜免疫系は防御の第一線として機能します。性器粘膜のより良い知識は、HIVを含む異なる病原体の病原性を理解するために不可欠です。ガンマデルタ（GD）T細胞が「非在来型」T細胞の原型であり、γおよびδ鎖からなるヘテロ二量体、T細胞受容体（TCR）の発現によって定義されるT細胞の比較的小さな部分集合を表します。これは、α-βのTCRによって定義される古典的なはるかによく知られているCD4 +ヘルパーT細胞およびCD8 +細胞傷害性T細胞から離れてそれらを設定します。 GD T細胞は、多くの場合、組織特異的局在化を示し、上皮に濃縮されます。 GD T細胞は、炎症、腫瘍監視、感染性疾患、および自己免疫における免疫応答を調整します。
ここでは、再現性のヒト子宮頸管上皮内GD Tリンパ球を分離し、分析するための方法を提示します。我々ヘクタール女性の省庁間のHIV感染に関する研究（WIHS）に参加した女性から使用子宮頸管細胞採取用ブラシサンプルVEの。膣粘膜の傷害が存在である条件中GD T細胞相互作用についての知識は、粘膜GD T細胞応答についての知識があり、膣microbicides.In追加の開発を含む、粘膜の脆弱性に対処している任意の臨床試験に適用することができます感染性疾患の治療におけるGD T細胞ベースの免疫療法の適用のための潜在。
Introduction
我々は、上皮内GD T細胞を評価するために、子宮頸管ブラシサンプルを使用する方法を開発しました。子宮頸管は円柱上皮の単層によって裏打ちされています。上皮内リンパ球は急速に病原性微生物7、8に遭遇すると、免疫応答を開始することができ、上皮層内に存在する現場のリンパ球を表します。子宮頸管上皮内コンパートメントの免疫学的事象を理解することは、HIVを含む感染を防止するための効果的な戦略の設計のために重要です。
私たちの方法は、さらに、HIV感染またはHIV感染のリスクがある女性では上皮内GD T細胞の役割を探求するために新鮮に採取したヒト子宮頸管のサンプルと同様に凍結した子宮頸管細胞に適用することができます。このプロトコルの主な目的は、子宮頸管上皮内コンパートメントにおける新規免疫学的事象を発見し、evaluatことですHIV感染女性における粘膜の脆弱性のマーカーとしての電子GD T細胞応答。
FGTの免疫周りの知識の大幅なギャップが部分的に成功した粘膜サンプルを収集し、処理の難しさに起因しています。また、複雑な粘膜免疫細胞の不均一性、および互いにそれらの相互関連性は、免疫系の状態と機能を反映する臨床的に関連する測定値を識別することに大きな課題です。我々はさらに、FRT免疫の基礎となるメカニズムを同定するために重要であり得る非常に多重化され、単一細胞技術を用いて分析することができる高度に精製された上皮内GD T細胞を得るための方法を開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
女性の下部生殖管の粘膜の脆弱性の評価は、HIV取得送信のリスクに対処する臨床試験の必須成分です。典型的には、HIV感染にFGTの脆弱性が性器分泌物（サイトカイン、ケモカインおよび抗菌ペプチド）12、13中の可溶性免疫調節を測定することによって評価されます。しかし、これらのバイオマーカーは、膣の炎症しか示している生理学的および病?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、この作業に参加する意欲のためにマイアミWIHSの研究参加者に感謝します。この原稿のデータは、マイアミの女性の省庁間HIV研究（WIHS）により回収しました。本書の内容はもっぱら著者の責任であり、国立衛生研究所（NIH）の公式見解を示すものではありません。この作品は、前進のための国立アレルギー感染症研究所と女性の省庁間のHIV感染の研究（WIHS）[助成金番号U01のAI103397]、アレルギーと国立感染症研究所、国立衛生研究所[助成金番号P30AI073961]、ナショナルセンターによってサポートされていましたトランスレーショナル科学とマイノリティの健康と健康格差に国立研究所、国立衛生研究所[助成金番号UL1TR000460と1KL2TR000461]、および国立小児保健発育研究所、国立衛生研究所[承認番号K23HD074489]。
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
