L'isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
La femmina tratto riproduttivo (FRT) mucosa sistema immunitario serve come la prima linea di difesa. Una migliore conoscenza della mucosa genitale è quindi essenziale per comprendere la patogenicità dei diversi agenti patogeni, tra cui l'HIV. Gamma Delta cellule (GD) T sono il prototipo delle cellule T "non convenzionali" e rappresentano una parte relativamente piccola sottogruppo di cellule T definite dalla loro espressione dei recettori delle cellule T eterodimeriche (TCR) composte da catene di gamma e delta. Questo li distingue dalle cellule T classici e molto meglio noti CD4 + helper e le cellule CD8 + T citotossici che sono definiti da TCR alfa-beta. cellule T GD spesso mostrano la localizzazione tessuto-specifica e sono arricchiti in epitelio. le cellule T GD orchestrare le risposte immunitarie a infiammazione, la sorveglianza del tumore, malattie infettive, e autoimmunità.
Qui, vi presentiamo un metodo per isolare ed analizzare riproducibile endocervicali intraepiteliale linfociti T GD umani. noi ettarove utilizzati campioni cytobrush endocervicali da donne che partecipano alle donne Interagency HIV Infection Study (WIHS). La conoscenza GD cellule T interazioni durante le condizioni in cui vi è un insulto alla mucosa vaginale potrebbe essere applicata a qualsiasi studio clinico in cui la vulnerabilità della mucosa è rivolta, compreso lo sviluppo di oltre microbicides.In vaginale, la conoscenza di risposte delle cellule della mucosa GD T ha possibilità di applicazione di GD T cell-based terapia immunitaria nel trattamento delle malattie infettive.
Introduction
Abbiamo sviluppato la metodologia di utilizzo di campioni endocervicali pennello per valutare le cellule T GD intraepiteliali. Il canale endocervicale è rivestito da un singolo strato di epitelio colonnare. Linfociti intraepiteliali rappresentano linfociti di prima linea che risiedono all'interno dello strato epiteliale che può rapidamente avviare risposte immunitarie su di incontrare microbi patogeni 7, 8. Comprendere gli eventi immunologici del vano intraepiteliale endocervicale è importante per la progettazione di strategie efficaci per prevenire le infezioni, compreso l'HIV.
Il nostro metodo può essere applicato per i campioni endocervicali umane appena raccolti, nonché le cellule endocervicali congelati per esplorare ulteriormente il ruolo delle cellule T GD intraepiteliale nelle donne con infezione da HIV o a rischio di infezione da HIV. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di scoprire nuovi eventi immunologici nel vano intraepiteliale endocervicale e evaluatle risposte delle cellule T e GD come marker di vulnerabilità della mucosa nelle donne con infezione da HIV.
Le lacune sostanziali nella conoscenza intorno FGT immunità sono in parte a causa della difficoltà di raccolta e l'elaborazione dei campioni delle mucose con successo. Inoltre, il complesso eterogeneità delle cellule immunitarie mucosali, e la loro interconnessione tra loro, sono sfide importanti per identificare misurazioni clinicamente rilevanti che riflettono lo stato e la capacità del sistema immunitario. Abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule altamente purificate intraepiteliali GD T che possono essere ulteriormente analizzate utilizzando altamente multiplex, tecnologie unicellulari che possono essere critiche per l'identificazione dei meccanismi alla base della FRT immunità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Valutazione della vulnerabilità femminile della mucosa del tratto genitale inferiore è una componente essenziale di studi clinici che affrontano il rischio di acquisizione e trasmissione del virus HIV. Tipicamente FGT vulnerabilità alle infezioni da HIV è valutata misurando immunomodulatori solubili nelle secrezioni genitali (citochine, chemochine e peptidi antimicrobici) 12, 13. Tuttavia, questi marcatori sono solo indicative di infiammazione vaginale, sono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i partecipanti allo studio Miami WIHS per la loro disponibilità a partecipare a questo lavoro. I dati in questo manoscritto sono stati raccolti dalle donne Miami Interagency HIV Study (WIHS). I contenuti di questa pubblicazione sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano le posizioni ufficiali del National Institutes of Health (NIH). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie infettive e Interagency HIV Infection Study femminile (WIHS) [concessione numero U01 AI103397], National Institute of Allergy e Malattie infettive, National Institutes of Health [codice di autorizzazione P30AI073961], Centro Nazionale per l'avanzamento traslazionale Scienze e l'Istituto nazionale sulla minoranza Salute e disparità, Istituto nazionale della Salute [codice di autorizzazione UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e National Institute of Child Health e lo sviluppo umano, National Institute of Health [codice di autorizzazione K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
