ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
באיברי הרבייה הנקביים (FRT) הרירית מערכת החיסון משמש כקו ההגנה הראשון. להכיר טוב יותר את רירית איברי המין ולכן הוא חיוני להבנת פתוגניות של פתוגנים שונים כולל איידס. דלתא גמא (GD) ותאי T הם האבטיפוס של "בלתי שגרתיים" תאי T והם מייצגים קבוצה קטנה יחסית של תאי T מוגדר על ידי הביטוי שלהם של קולטני תאי T heterodimeric (TCRs) מורכב שרשראות גמא דלתא. זה שמבדיל אותם מתאי הקלסיים הרבה יותר טוב ידוע CD4 + T מסייע תאי CD8 + T ציטוטוקסיים המוגדרים על-ידי TCRs בטא-אלפא. תאי GD T לעתים קרובות להראות לוקליזציה רקמות ספציפיות ומועשרים ב האפיתל. תאי GD T לתזמר תגובה חיסונית דלקת, מעקב גידול, מחלות זיהומיות, אוטואימוניות.
כאן, אנו מציגים שיטה לבודד reproducibly ולנתח לימפוציטים GD T האנדוצרוויקאלית האדם intraepithelial. אנו חהve דגימות cytobrush האנדוצרוויקאלית בשימוש מנשים שהשתתפו במחקר זיהום נשים בין-HIV (WIHS). יש ידע על אינטראקציות תאי GD T במהלך תנאים שבם יש עלבון הרירי בנרתיק יכול להיות מיושם על כל ניסוי קליני נוסף בו פגיעות ריריות הופנה, כולל הפיתוח בנוסף microbicides.In נרתיק, ידע על תגובות תא הרירי GD T פוטנציאל היישום של טיפול החיסוני מבוסס תאי GD T בטיפול במחלות זיהומיות.
Introduction
פיתחנו מתודולוגיה של שימוש בדגימות מברשת האנדוצרוויקאלית להעריך תאים GD T intraepithelial. התעלה האנדוצרוויקאלית מצופה בשכבה אחת של אפיתל עמודי. לימפוציטים intraepithelial מייצגים לימפוציטים חזית המתגוררים בתוך שכבת האפיתל שיכול ליזום תגובה חיסונית במהירות כשנתקלה 7 חיידקים פתוגניים, 8. הבנת האירועים אימונולוגיים של תא האנדוצרוויקאלית intraepithelial חשוב בעיצוב של אסטרטגיות אפקטיביות כדי למנוע זיהומים, כולל איידס.
השיטה שלנו יכול להיות מיושם על דגימות האנדוצרוויקאלית אדם טרי שנאספו כמו גם תאים אנדוצרוויקאלי קפוא כדי להמשיך לחקור את התפקיד של תאי T GD intraepithelial בנשים עם זיהום HIV או בסיכון הידבקות ב- HIV. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לגלות אירועים אימונולוגיים רומן תא intraepithelial האנדוצרוויקאלית וכדי evaluatדואר GD תגובות תא T כסמן של פגיעות ריריות בנשים עם זיהום HIV.
הפערים המשמעותיים בידע סביב חסינות FGT נובעים בחלקם הקושי לאסוף בהצלחה ועיבוד דגימות ריריות. יתר על כן, ההטרוגניות המורכבות של תאים חיסוניים ריריים, ואת הקשרים הפנימיים שלהם אחד עם השני, הם אתגרים מרכזיים לזיהוי מדידות רלוונטיות קליני המשקפים המדינה ואת היכולת של המערכת החיסונית. פתחנו שיטה להשיג תאים מטוהרים intraepithelial מאוד GD T שיכול להיות עוד יותר לנתח באמצעות טכנולוגיות מרובבות ביותר, תא בודד שעשויה להיות קריטי לזיהוי המנגנונים של חסינות FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכת הפגיעות ריריות בדרכי נשית תחתונות איברי מין היא מרכיב חיוני של מחקרים קליניים פונים סיכון רכישת HIV ושידור. בדרך כלל פגיעות FGT מפני הדבקה ב- HIV מוערכות על ידי מדידת מאפננים חיסוניים מסיסים הפרשות איברי מין (ציטוקינים, chemokines ופפטידים מיקרוביאלית) 12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים משתתפי המחקר מיאמי WIHS על נכונותם להשתתף בעבודה זו. נתונים בכתב היד הזה היו שנאספו במסגרת פרויקט HIV Interagency של מיאמי נשים (WIHS). התכנים של פרסום זה הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות ולימוד זיהום HIV Interagency לנשים (WIHS) [AI103397 U01 מספר מענק], המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק P30AI073961], המרכז הלאומי לקידום מדעי translational לבין המכון הלאומי לבריאות המיעוט ופערים הבריאות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק UL1TR000460 ו 1KL2TR000461], המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, המכון הלאומי לבריאות [K23HD074489 מספר מענק].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
