Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
Die weiblichen Fortpflanzungstrakt (FRT) Schleimhaut-Immunsystem dient als erste Verteidigungslinie. Bessere Kenntnis der Genitalschleimhaut ist daher wesentlich für das Verständnis der Pathogenität von verschiedenen Krankheitserregern wie HIV. Gamma delta (GD) T-Zellen sind der Prototyp "unkonventionelle" T-Zellen und eine relativ kleine Teilmenge von T-Zellen durch ihre Expression von heterodimeren T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die aus gamma und delta-Ketten definiert darstellen. Das unterscheidet sie von den klassischen und viel besser CD4 + T – Helferzellen und CD8 + zytotoxischen T – Zellen bekannt , die durch Alpha-Beta – TZR definiert sind. GD-T-Zellen zeigen häufig gewebespezifische Lokalisation und in Epithel angereichert. GD T-Zellen dirigieren Immunreaktionen bei der Entzündung, Tumorüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen.
Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbar zu isolieren und die menschliche endocervical intraepitheliale GD T-Lymphozyten zu analysieren. Wir have verwendet endocervical Zytobürste Proben von Frauen in der Frauen-Vermittlungs-HIV-Infektion Study (WIHS) teilnehmen. Das Wissen über GD-T-Zellen-Wechselwirkungen bei Bedingungen, in denen es eine Beleidigung für die vaginale Schleimhaut ist, könnte zu einer klinischen Studie angewendet werden, bei denen der Schleimhaut Anfälligkeit gerichtet ist, einschließlich der Entwicklung von vaginalen microbicides.In hinaus sind Kenntnisse über Schleimhaut GD T-Zell-Reaktionen hat Potenzial für die Anwendung der GD T-Zell-basierte Immuntherapie bei der Behandlung von Infektionskrankheiten.
Introduction
Wir entwickelten Methodik der Verwendung von endozervikalen Bürstenproben intraepitheliale GD-T-Zellen zu bewerten. Der Endozervikalkanal wird durch eine einzige Schicht von Epithel ausgekleidet. Intraepitheliale Lymphozyten repräsentieren Front – Lymphozyten in der Epithelschicht Wohnsitz, die sich schnell Immunreaktionen auslösen können pathogene Mikroben 7 nach der Begegnung, 8. die immunologischen Ereignisse des endozervikalen intraepitheliale Kompartiment zu verstehen, ist für das Design von wirksamen Strategien wichtig zur Verhinderung von Infektionen, einschließlich HIV.
Unser Verfahren kann für frisch gesammeltem humanen endozervikalen Proben sowie gefrorene endozervikalen Zellen angewendet werden, um die Rolle von intraepithelialen GD T-Zellen bei Frauen mit HIV-Infektion erforschen oder einem Risiko für eine HIV-Infektion. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, neue immunologische Ereignisse in endocervical intraepitheliale Raum zu entdecken und zu evaluate GD T-Zell-Antworten als Marker mit einer HIV-Infektion bei Frauen Anfälligkeit der Schleimhaut.
Die erheblichen Lücken im Wissen um FGT Immunität sind teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der erfolgreichen Erfassung und Verarbeitung Schleimhautproben. Darüber hinaus ist die komplexe Heterogenität der Schleimhautimmunzellen und deren Vernetzung untereinander, sind große Herausforderungen zu klinisch relevanten Messungen zu identifizieren, die den Zustand und die Fähigkeit des Immunsystems widerspiegeln. Wir entwickelten eine Methode, hochgereinigtes intraepitheliale GD-T-Zellen zu erhalten, die weiter analysiert werden können hoch Multiplex, Single-Cell-Technologien, die für die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen von FRT Immunität von entscheidender Bedeutung sein kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewertung der weiblichen Genitaltrakts unteren Anfälligkeit Schleimhaut ist ein wesentlicher Bestandteil von klinischen Studien Risiko einer HIV-Erfassung und Übertragung Adressierung. Typischerweise wird FGT Anfälligkeit für eine HIV – Infektion durch Messung löslichen Immunmodulatoren in Genitalsekreten (Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide) bewertet 12, 13. Allerdings sind diese Biomarker nur indikativ für vaginale Entzündung, werden von phy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Studienteilnehmern Miami WIHS für ihre Bereitschaft, an dieser Arbeit teilzunehmen. Die Daten in diesem Manuskript wurden von der Vermittlungs-HIV-Studie Miami gesammelt Frauen (WIHS). Der Inhalt dieser Veröffentlichung sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht die offizielle Position der National Institutes of Health (NIH) darstellen. Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten unterstützt und Vermittlungs-HIV-Infektion Studie Frauen (WIHS) [Gewährungsnummer U01 AI103397], Nationales Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, National Institutes of Health [Grant-Nummer P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences und das Nationale Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten, National Institute of Health [Gewährungsnummer UL1TR000460 und 1KL2TR000461] und National Institute of Child Health und Human Development, National Institute of Health [Gewährungsnummer K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
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