Clostridium difficile er en av de viktigste årsakene til sykehus antibiotika-assosiert diaré infeksjoner ^1. Dette Gram-positive anaerob bakterie er overført gjennom sin spore form via fekal-oral rute. I det siste tiåret, ny '' epidemi '' eller '' hypervirulent '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsaket en drastisk økning i nye infeksjoner og dødsfall priser i Nord-Amerika og Europa ^to. C. difficile -associated sykdom (CDAD) er en livstruende tykktarmsbetennelse med høye dødsfall priser ^3. Symptomene varierer fra diaré ⁴ til pseudomembranøs kolitt ⁵ og ofte dødelig toksisk megakolon ^6.

Behandling av CDAD er vanskelig som de virulente stammer er multiresistent og tilbakefall er høy ^7. I øyeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitisvis tilbakevendende tilfeller fekal microbiota transplantasjon. Nye terapeutiske strategier er sterkt behov ^8. Noen fremgang er registrert som terapeutisk monoklonalt antistoff Bezlotoxumab, rettet mot C. difficile toksin B ^9, har nylig bestått fase III kliniske studier, og ble innlevert for godkjenning hos FDA og EMA. I tillegg er nye antibiotika blir testet i øyeblikket på ulike stadier av kliniske studier ^10.

Å utvikle effektive behandlingen nye terapeutiske mål må identifiseres. Den nylig oppdaget C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-en (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) er en slik lovende mål, som mangel på PPEP-en i en knock-out belastningen avtar virulens av C . difficile in vivo ^11. PPEP-en er et utskilt metalloprotease ^12,13 spalte to C. difficile adhesinene på deres C-terminale ¹³ dermed frigjøre tilhenger bakterielleia fra den menneskelige tarmen epitel. Derfor er det involvert i å opprettholde balansen mellom de fastsittende og bevegelige fenotype av C. difficile. Å utvikle selektive hemmere mot PPEP-en og for å forstå hvordan den gjenkjenner sine underlag intim kjennskap til sin tredimensjonale struktur er uunnværlig. Vi har løst den første krystallstrukturen av PPEP-1 alene og i kompleks med et substratpeptid ^14. PPEP-1 er det første kjente protease som selektivt spalter peptidbindinger mellom to prolinrester ^15. Det binder substratet i en dobbel knekk måte og stabiliserer den til en utvidet alifatisk-aromatisk nettverk av rester som befinner seg i S-sløyfe som dekker protease aktivt sete ^14. Dette substrat-bindende modus er unik for PPEP-en og som ikke finnes i humane proteaser til dags dato. Dette gjør det til en lovende medikament mål, og off-target effekter av hemmere svært usannsynlige.

Å utvikle og skjerm selektiv PPEP-en inhibitors i fremtiden en stor mengde ren og monodisperse PPEP-1-proteinet er nødvendig. Videre, for å bestemme hvilken modus av binding av første inhibitorer, co-krystallstrukturer med PPEP-en er nødt til å bli bestemt. I våre hender PPEP-en produserer stadig vokst krystaller. Dermed har vi utviklet en optimalisering prosedyre for å produsere enkle diffraksjon kvalitet krystaller av PPEP-en. I denne protokollen beskriver vi i detalj produksjon, rensing, krystallisering og struktur løsning av PPEP-1 ^14. Vi bruker intracellulær ekspresjon i Escherichia coli av et PPEP-en variant som mangler sekresjon-signalsekvensen, affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi med fjernelse av rensingen tag, etterfulgt av microseeding ¹⁶ inn i en optimaliserings skjerm og strukturbestemmelse via sink enkelt-bølgelengde anomal dispersjonen (sink-SAD) ^17. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon og strukturbestemmelse av andre proteiner (for eksempel </ Em> metalloproteaser) og spesielt for proteiner som produserer vokst krystaller. På forespørsel plasmid DNA av konstruksjonen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraksjon data kan være tilgjengelig for pedagogiske formål.