Diferenciación in vitro de las células CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 ⁺ células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva ^1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master' factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de doble filo en el sistema inmunológico, ya que también pueden obstaculizar la inmunidad antitumoral en ciertas configuraciones ^2. La manipulación terapéutica del número y función de Treg es, por tanto, objeto de numerosas investigaciones clínicas. En el cáncer, agotamiento de las células T reguladoras puede ser deseable y algo de éxito de los enfoques clínicos alienta además a la investigación ^3. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, además de los efectos terapéuticos de células T reguladoras en sevemodelos de enfermedad del ratón ral, los últimos primeros ensayos en el hombre de la transferencia adoptiva de Treg para prevenir la enfermedad injerto contra -host (EICH) ^{4 – 7} y para evaluar la seguridad en el tratamiento de la diabetes tipo 1 ⁸ mostró resultados muy prometedores.

De origen natural Treg (nTregs) comprenden tTregs del timo derivados y pTregs periférica inducida, con funciones esenciales no redundantes en el mantenimiento de salud ^{9 – 11.} Sin embargo, los números nTreg son limitados, fomentando el enfoque complementario de inducir Tregs (iTregs) in vitro a partir precursores de células T ingenuas ^12. Aún así la estabilidad de iTregs, presumiblemente debido a la falta de la desmetilación en la llamada región desmetilado Treg-específico (TSDR) en el locus del gen FOXP3 ^13, sigue siendo una preocupación y varios estudios indican que in vivo inducida por células T reguladoras son más estables ^14.

Hasta la fecha, FOXP3 sigue siendo la mejor proteína MArker para Tregs pero no es absolutamente específico porque las células CD4 + CD25- T convencionales humanos transitoriamente expresan niveles intermedios de FOXP3 tras la activación ^15,16. Aunque se han hecho progresos significativos en el esclarecimiento de la regulación de la expresión de FOXP3, aún queda mucho por descubrir en cuanto a la inducción, la estabilidad y la función de FOXP3 en particular en las células humanas. A pesar de las diferencias a nTregs, in vitro inducida FOXP3 + células T CD4 ⁺ se pueden utilizar como un sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de inducción FOXP3 y como punto de partida para desarrollar protocolos en el futuro que permiten la generación de iTregs que son más similares en el vivo generada células T reguladoras, que podría ser aplicable para las estrategias de transferencia adoptiva en el futuro.

No existe un protocolo `standard' oro para inducir iTregs humanos y los protocolos actuales se han desarrollado sobre la base de condiciones que imitan Treg que inducen in vivo: la interleucina 2 (IL-2) Y la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF-β) son cruciales para la inducción FOXP3 in vivo ^17, y el ácido trans-retinoico (ATRA) – que se produce in vivo por las células dendríticas asociados al intestino – se utiliza con frecuencia para mejorar la inducción FOXP3 in vitro ^18-21. Hemos desarrollado protocolos de Treg inductores humanos adicionales utilizando butirato ^22, un ácido graso de cadena corta derivado de la microbiota intestinal que recientemente ha presentado un incremento murino Treg inducción ^23,24. También establecimos recientemente un nuevo protocolo para la generación de iTregs con función supresora superior en vitro mediante el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina ^22, siendo este último un objetivo de mamíferos clínicamente aprobado de la rapamicina (mTOR) inhibidor que es conocido por promover FOXP3 de mantenimiento durante la expansión de Treg humanos ^25,26.

Este método describe la reproducible enla generación in vitro de las células CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando un conjunto de condiciones diferentes, y su posterior fenotipificación mediante citometría de flujo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para revelar patrones específicos del protocolo de expresión de FOXP3 y otras firmas de moléculas Treg tales como CD25, CTLA-4, EOS, así como la represión de IFN-γ y expresión SATB1 ^22. Las poblaciones celulares generadas se pueden utilizar para ensayos funcionales respecto a la actividad de supresión o para estudios moleculares, ya sea en relación con los reguladores generales FOXP3 o para estudiar los efectos específicos a ciertos compuestos, tales como butirato o rapamicina. Una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación de Treg es altamente relevante para futuras estrategias terapéuticas en autoinmunidad o cáncer para apuntar específicamente a las moléculas que participan en la generación y la función de Treg.