In Vitro Дифференциация человеческого CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 ⁺ Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол

CD4 + CD25 + FOXP3 + регуляторные Т – клетки (Tregs) подавляют другие иммунные клетки и являются критическими медиаторами периферической толерантности, предотвращая аутоиммунные и чрезмерное воспаление ^1. Важность Tregs можно проиллюстрировать на примере человеческой болезни immunodysregulation polyendocrinopathy энтеропатия Х-хромосомой синдромом (IPEX), в котором потеря Tregs из-за мутаций в `master' Treg фактора транскрипции Forkhead коробки P3 (FOXP3) приводит к тяжелым системным аутоиммунным заболеванием, летальной в раннем возрасте. Тем не менее, Tregs действовать как обоюдоострый меч в иммунной системе , поскольку они также могут препятствовать противоопухолевый иммунитет в определенных условиях ^2. Терапевтическая манипуляция числа Treg и функции, поэтому предметом многочисленных клинических исследований. При раке, истощение Tregs может быть желательным и некоторый успех клинических подходов стимулирует дальнейшие исследования ^3. При аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в дополнение к терапевтическим эффектам Tregs в Seveмодели заболевания RAL мыши, недавние первые испытания в-человека усыновителей передачи Treg для предотвращения трансплантат против -host (РТПХ) ^{4 – 7} и для оценки безопасности при лечении диабета типа 1 ⁸ показали весьма обнадеживающие результаты.

Встречающиеся в природе Tregs (nTregs) содержат тимуса производные tTregs и периферического индуцированные pTregs, с нерезервированных важных функций в поддержании здоровья ^{9 – 11.} Тем не менее, цифры nTreg ограничены, поощряя дополнительный подход индукции Tregs (iTregs) в пробирке из наивных предшественников Т – клеток ^12. Тем не менее устойчивость iTregs, предположительно , из – за отсутствия деметилирования в так называемой Трег-специфической деметилируется области (TSDR) в гене FOXP3 локуса ^13, остается проблемой , и некоторые исследования указывают на то, что в естественных условиях индуцированной Tregs более стабильны ^14.

На сегодняшний день FOXP3 остается лучшим белком мarker для Tregs , но это не совсем специфический , потому что человеческие обычные CD4 + CD25- Т – клетки скоротечно выражают промежуточные уровни FOXP3 при активации ^15,16. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выяснении регуляции экспрессии FOXP3, многое еще предстоит открыть в отношении индукции, стабильности и функции FOXP3 особенно в клетках человека. Несмотря на различия в nTregs, в пробирке индуцированной FOXP3 + CD4 ⁺ Т – клетки могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов индукции FOXP3 и в качестве отправной точки для разработки протоколов в будущем , которые позволяют поколения iTregs, которые более похожи на в Vivo сгенерированный Tregs, который может быть применим для усыновителей стратегий передачи в будущем.

Там нет `золотой standard' протокол , чтобы побудить человека iTregs, и в настоящее время протоколы были разработаны на основе имитируя Treg-индуцирующие условия в естественных условиях: интерлейкин – 2 (IL-2) И трансформирующий фактор роста β (TGF-β) сигнализации имеют решающее значение для FOXP3 индукции в естественных условиях ^17, и все-транс – ретиноевой кислоты (ATRA) – который производится в естественных условиях с помощью связанной с кишечником дендритных клеток – часто используется для повышения индукции FOXP3 в пробирке ^{18 – 21.} Мы разработали дополнительные человеческие Трег индуцирующего протоколы с использованием бутират ^22, кишечную флору, происходящей с короткой цепью жирной кислоты , что недавно было показано , чтобы увеличить мышиный Treg индукции ^23,24. Мы также недавно установили новый протокол для генерации iTregs с превосходной функцией подавляющих в пробирке, используя комбинацию TGF-бета, ATRA и рапамицина ^22, причем последний клинически одобрен целевой рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибитор , который , как известно, содействовать техническое обслуживание FOXP3 в процессе расширения Treg человека ^25,26.

Этот метод описывает воспроизводимавитро поколение человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs с использованием набора различных условий, и их последующего фенотипирования с помощью проточной цитометрии и количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) , чтобы выявить закономерности , специфичные для протокола экспрессии FOXP3 и других Treg молекул подписи таких , как CD25, CTLA-4, EOS, а также репрессии IFN-gamma и экспрессии SATB1 ^22. Сформированные клеточные популяции могут быть использованы для функциональных анализов в отношении супрессивной активности или для молекулярных исследований, либо в отношении общих регуляторов FOXP3 или для изучения эффектов, характерных для определенных соединений, таких как бутират или рапамицином. Дальнейшее понимание молекулярных механизмов вождения Treg дифференциации является весьма актуальным для будущих терапевтических подходов в аутоиммунитета или рака специфически молекул-мишеней, участвующих в генерации и функции Treg.