Na diferenciação in vitro de células T CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 ⁺ usando um protocolo de TGF-β contendo

As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva ^1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master' Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determinadas configurações ^2. manipulação terapêutica de número e função Treg é, portanto, sujeitas a inúmeras investigações clínicas. No câncer, esgotamento de Tregs pode ser desejável e algum sucesso de abordagens clínicas incentiva novas pesquisas ^3. Em doenças auto-imunes e inflamatórias, além de efeitos terapêuticos de Tregs em Sevemodelos de doenças de rato RAL, recentes primeiros ensaios em-man de transferência de Treg adotiva para evitar enxertia versus doença -host (GVHD) ^4-7 e para avaliar a segurança no tratamento de diabetes tipo 1 ⁸ mostraram resultados muito promissores.

Que ocorre naturalmente Tregs (nTregs) compreendem tTregs derivado de timo e pTregs induzidas perifericamente, com funções essenciais não redundantes na manutenção da saúde ^9-11. No entanto, os números nTreg são limitados, estimulando a abordagem complementar de induzir Tregs (iTregs) in vitro a partir de precursores de células T naive ^12. Ainda estabilidade de iTregs, presumivelmente devido à falta de desmetilação na chamada região específica desmetilado Treg-(TSDR) no locus do gene FOXP3 ^13, continua a ser uma preocupação e vários estudos indicam que in vivo induzida Tregs são mais estáveis ^14.

Até à data, FOXP3 continua a ser a melhor proteína marker para Tregs mas não é absolutamente específico, porque as células T CD4 + CD25- humanas transientemente convencionais expressar níveis intermediários de FOXP3 após activação ^15,16. Embora o progresso significativo foi feito para elucidar a regulação da expressão de FOXP3, ainda há muito a ser descoberto sobre a indução, a estabilidade ea função do FOXP3 particularmente em células humanas. Apesar das diferenças para nTregs, in vitro induzida FOXP3 + células T CD4 ⁺ pode ser usado como um sistema modelo para estudar os mecanismos moleculares da indução FOXP3 e como um ponto de partida para desenvolver protocolos no futuro, que permitem a geração de iTregs que são mais semelhantes às de vivo gerado Tregs, que pode ser aplicável para as estratégias de transferência adoptivos no futuro.

Não há `protocolo standard' ouro para induzir iTregs humanos, e Current Protocols foram desenvolvidos com base em condições simulando Treg indutores in vivo: interleucina 2 (IL-2) E sinalização transformando β do factor de crescimento (TGF-β) são cruciais para a indução FOXP3 in vivo ^17, e o ácido trans-retinóico (ATRA) – que é produzido in vivo por células dendríticas associados ao intestino – é frequentemente usado para melhorar a indução FOXP3 in vitro ^18-21. Nós desenvolvemos protocolos Treg indutores humanos adicionais utilizando butirato de ^22, um ácido gordo de cadeia curta da flora intestinal derivado que foi recentemente mostrado para aumentar murino Treg indução ^23,24. Nós também estabeleceu recentemente um novo protocolo para a geração de iTregs com função supressora superior em vitro, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina ^22, sendo este último um alvo de mamífero clinicamente aprovado de rapamicina (mTOR) inibidor que é conhecido por promover manutenção FOXP3 durante humana Treg expansão ^25,26.

Este método descreve o reprodutível emgeração in vitro de células T CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando um conjunto de condições diferentes, e a sua fenotipagem subsequente por citometria de fluxo e a reacção inversa em cadeia da polimerase de transcrição quantitativo (qRT-PCR) para revelar os padrões específicos do protocolo de expressão de FOXP3 e outros assinatura moléculas Treg tais como CD25, CTLA-4, EOS, bem como a repressão do IFN-γ e expressão SATB1 ^22. As populações celulares geradas podem ser utilizadas para ensaios funcionais quanto à actividade supressora ou para estudos moleculares, quer se trate de reguladores gerais FOXP3 ou para estudar os efeitos específicos para determinados compostos, tais como o butirato ou rapamicina. Uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de condução diferenciação Treg é altamente relevante para abordagens terapêuticas futuras em auto-imunidade ou câncer visarem especificamente moléculas envolvidas na geração e função Treg.