La differenziazione in vitro di cellule CD4 ⁺ umana FOXP3 ⁺ indotta da T regolatorie (iTregs) da ^cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Cellule T regolatorie CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) sopprimere le altre cellule del sistema immunitario e sono mediatori critici di tolleranza periferica, impedendo autoimmunità ed eccessiva infiammazione ^1. L'importanza di Tregs è esemplificata dalla malattia umana sindrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia legata all'X (IPEX), in cui la perdita di Tregs a causa di mutazioni nel master' Treg fattore di trascrizione forkhead box P3 `(FOXP3) porta ad una grave malattia autoimmune sistemica, letale in tenera età. Tuttavia, Tregs agire come una spada a doppio taglio nel sistema immunitario in quanto possono anche ostacolare l'immunità anti-tumorale in alcune impostazioni ^2. manipolazione terapeutica del numero e della funzione Treg è quindi soggetto a numerose indagini cliniche. Nel cancro, l'esaurimento delle Tregs può essere desiderabile e un certo successo degli approcci clinici incoraggia ulteriori ricerche ^3. Nelle malattie autoimmuni e infiammatorie, in aggiunta agli effetti terapeutici di Tregs in sevemodelli di malattia del mouse RAL, recenti prove in-man di trasferimento adottivo Treg per prevenire graft- contro -host malattia (GvHD) ^4-7 e per valutare la sicurezza nel trattamento del diabete di tipo 1 ⁸ ha mostrato risultati molto promettenti.

Presenti in natura Tregs (nTregs) comprendono tTregs timiche-derivati e pTregs perifericamente indotte, con funzioni essenziali non ridondanti nel mantenimento della salute ^{9 – 11.} Tuttavia, i numeri nTreg sono limitate, favorendo l'approccio complementare di indurre Tregs (iTregs) in vitro da precursori delle cellule T naive ^12. Ancora stabilità iTregs, presumibilmente a causa della mancanza di demetilazione nella cosiddetta regione demetilato Treg-specifico (TSDR) nel locus genico FOXP3 ^13, rimane una preoccupazione e diversi studi indicano che in vivo indotto Tregs sono più stabili ^14.

Fino ad oggi, FOXP3 rimane la migliore proteina mArker per Tregs ma non è assolutamente specifica perché convenzionali cellule CD4 + CD25- T umani transitoriamente esprimono livelli intermedi di FOXP3 all'attivazione ^15,16. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire la regolazione dell'espressione FOXP3, resta molto da scoprire per quanto riguarda l'induzione, la stabilità e la funzione di FOXP3 in particolare nelle cellule umane. Nonostante le differenze a nTregs, in vitro indotta FOXP3 + cellule T CD4 ⁺ possono essere utilizzati come sistema modello per studiare i meccanismi molecolari dell'induzione FOXP3 e come punto di partenza per sviluppare protocolli in futuro che consentono la generazione di iTregs più simili al vIVO generato Tregs, che potrebbe essere applicabile per le strategie di trasferimento adottivo in futuro.

Non vi è alcun `protocollo d'oro standard' per indurre iTregs umani, e attuali protocolli sono stati sviluppati sulla base di mimare condizioni Treg-inducono in vivo: interleuchina 2 (IL-2) E fattore di crescita trasformante β (TGF-β) di segnalazione sono cruciali per l'induzione FOXP3 in vivo ^17, e all-trans retinoico (ATRA) – che è prodotto in vivo dalle cellule dendritiche intestinali associate – viene spesso utilizzato per migliorare l'induzione FOXP3 in vitro ^{18 – 21.} Abbiamo sviluppato ulteriori protocolli Treg-inducono umani utilizzando butirrato ^22, un acido grasso a catena corta flora intestinale di derivazione che è stato recentemente dimostrato per aumentare murino Treg induzione ^23,24. Abbiamo inoltre recentemente istituito un nuovo protocollo per la generazione di iTregs con funzione di soppressiva superiore in vitro utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina ^22, quest'ultimo è un mammalian target clinicamente approvato rapamicina (mTOR) inibitore che è noto per la promozione manutenzione FOXP3 durante umana espansione Treg ^25,26.

Questo metodo descrive la riproducibile invitro generazione di CD4 umana + FOXP3 + iTregs utilizzando una serie di condizioni diverse, e la loro successiva fenotipizzazione mediante citometria di flusso e la reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) per rivelare i modelli specifici del protocollo di espressione di FOXP3 e altre molecole di firma Treg tali come CD25, CTLA-4, EOS, così come la repressione di IFN-γ e di espressione SATB1 ^22. Le popolazioni cellulari generati possono essere utilizzati per saggi funzionali relative attività soppressiva o per studi molecolari, né riguardo regolatori generali FOXP3 o per studiare gli effetti specifici di alcuni composti come butirrato o rapamicina. Ulteriore comprensione dei meccanismi molecolari di guida differenziazione Treg è molto importante per i futuri approcci terapeutici in autoimmunità o il cancro per indirizzare specificamente molecole coinvolte nella generazione e la funzione Treg.